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1、 料推荐实验室主题文件编号F07临沧市第二人民医院标本处理(核酸纯第 1 页共 4页第 1 版第 0次修改检验科分子生物实验室化)标准操作程序撰写日期: 2015.11.201 目的:保证标本处理标准化、规范化,使不规范操作因素对实验结果造成的影响减至最小。2 适用范围:乙型肝炎病毒核酸提取、解尿支原体核酸提取、沙眼衣原体核酸提取、 HPV核酸提取、 HCV核酸提取、结核杆菌核酸提取、淋球菌核酸提取。3 操作人:李成庭、李丽蒙、高子文 李华娇 张国华4 标准操作程序4.1 乙型肝炎病毒( DNA血清)1)双手戴上手套,从冰箱取出标本,将离心管依次编号。2)取出 1.5ml 离心管,对应标本编号
2、,置于离心管架上。3)将移液器调到 70l ,先混匀 DNA提取液,再吸取 70l加入到已编号的离心管中。然后吸取 30l血清,加入离心管中混匀,注意每吸取一份血清标本应更换一次枪头。 处理全部标本, 然后将离心管插到金属浴孔内, 100加热 10 分钟。4)裂解完成后将离心管取出,然后10000rpm离心 5 分钟,取上清液20l加样上机。5)收拾台面至准备状态。4.2 CT 、UU、NGH DNA(分泌物)1)双手戴上手套,从冰箱取出标本,将化验单和离心管依次编号。2)双手换上新手套,取出1.5ml 灭菌离心管,对应标本编号,置于1 料推荐离心管架上。3)向有棉拭子的离心管中加入 2ml
3、无菌生理盐水,振荡混匀,将混悬液用移液器吸取 1.0ml 加入到已编号的离心管中。 10000rpm 离心 5 分钟,弃上清液,留取沉淀加 50 微升 DNA提取液混匀,金属浴 100 加热 10 分钟。4)裂解完成后取出离心管, 然后 10000rpm离心 5 分钟,取上清液 2l加样上机。5)收拾台面至准备状态。4.3 结核杆菌( DNA 痰液、胸腹水等)1)双手戴上手套,从冰箱取出标本,将化验单和离心管依次编号。2)双手换上新手套,取出1.5ml 灭菌离心管,对应标本编号,置于离心管架上。3)用移液器吸取 4 倍体积 4%NaOH到痰液容器,液化 30 分钟,用移液器调吸取 1ml 加入
4、到已编号的离心管中,然后 10000rpm离心 5 分钟,弃上清,留取沉淀,用无菌生理盐水洗涤两次,沉淀加50ulDNA提取液,充分震荡混匀。胸腹水、脑脊液直接混匀后,用移液器调吸取 1ml 加入到已编号的离心管中,然后10000rpm离心 5 分钟,弃上清,留取沉淀,加 50ulDNA提取液,充分震荡混匀。然后将离心管插到金属浴孔内, 100加热 10 分钟。4)裂解完成后将离心管取出,然后10000rpm离心 5 分钟,取上清液2l加样上机。5)收拾台面至准备状态。2 料推荐4.4 丙型肝炎病毒RNA(血清)1) 双手戴上手套,从冰箱取出标本,将离心管依次编号。2)取出 1.5ml 灭菌离
5、心管,对应标本编号,置于离心管架上.3)1.5ml无菌管加入 50ul 蛋白酶 K200ul 血清 200ul 裂解液混匀 72加热 10min(同时将洗脱液 72预热)加入 250ul 无水乙醇将混合液全部吸至离心柱 12000rpm/1min将离心柱装在新的收集管中加 500ul 抑制物去除液 12000rpm/1min将离心柱装在新的收集管中加 500ul 去离子液 12000rpm/1min将离心柱装在新的收集管中再加 500ul 去离子液 12000rpm/4min将离心柱装在 1.5ml的离心管中,开盖 72/2min 在离心柱正上方加入72预热的洗脱液 35ul, 盖盖 1400
6、0rpm/1min, 离心管内即病毒核酸溶液, 最好立即使用,如需保存,置 -20 。注:配试剂蛋白酶 K+1.375ml 洗脱液,混匀, -20 保存CarrierRNA+110ul 内标液混匀, -20 保存去离子浓缩液 +44ml 无水乙醇裂解工作液 :1 人份病毒裂解液200ul+ CarrierRNA4ul,现用现配(根据标本数依次增加)。PCR试剂 HCV反应液 A-2ul, HCV 反应液 B-3ul,HCV 反应液 C-25ul 混匀(根据标本数依次增加) 。4.5 乳头瘤病毒 DNA(宫颈样本)1) 双手戴上手套,从冰箱取出标本,将离心管依次编号后。3 料推荐2)取出 1.5ml 灭菌离心管,对应标本编号,置于离心管架上.3)向有样本刷的离心管中加入 2ml 无菌生理盐水,振荡混匀,将混悬液用移液器吸取 1.0ml 加入到已编号的离心管中。 10000rpm 离心 5 分钟,弃上清液,留取沉淀加 50 微升 DNA提取液混匀,金属浴100加热 10 分
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