食品中大小分子互作用幻灯片

1、1,食品中大分子与小分子的相互作用,2,01,02,03,04,引言,光谱学技术探究食品中的大小分子互作,热力学技术探究食品中的大小分子互作,分子模拟及其他相关技术,CONTENT,05,结语,3,01,引言,PART ONE,4,01,生物大分子主要为,蛋白质,多糖、核酸等,在与小分子相互作用研究中涉及的小分子种类繁多，主要有内源物质,中性分子、离子,食品营养成分及添加剂,表面活性剂,药物,包括抗癌药物,抗菌素药物、心血管类药物、杀虫剂、生物毒剂等,及制剂辅料、蛋白质的,变性剂以及蛋白质,DNA,测试探针试剂等,大分子与小分子,5,02,相互作用类型,蛋白质,小分子与蛋白质间多是非共价键的作

2、用,包括静,电作用、氢键、范德华力等,虽然非共价相互作用很弱,一般,小于,10kJ/mol,比通常的共价键键能小,1,2,个数量级,作用,范围为,0.3,0.5nm,但这些分子间弱相互作用力可在一定条,件下起加合与协同作用,形成有一定方向性和选择性的强作,用力,而这种强作用力是分子识别与组装的基础,核酸,DNA,与靶向分子之间的相互作用主要有非共价键,作用、共价键作用和剪切作用三种。非共价键相互作用的,方式主要有,1,外部静电结合,Electrostatic Binding,2,沟区,大沟区、小沟区,结合,Groove Binding,3,嵌插结合,Imercalative Binding,多

3、糖,多糖类大分子可以通过静电力和疏水效应等弱相互,作用力与小分子如表面活性剂发生相互作用,从而使混合体,系的性能不同于单一体系者,6,03,研究思路,形成复合物,性质改变,分析方法,获得信息,大分子与小分子物质作用后生成超分子复合物,体系中大分子或者小分子物质的浓度、光谱、电化学等性质发生改变,通过适当的分析方法，测定作用前后不同参数的变化值,可以获得作用机理、结合常数、结合位置、结合位点数、作用力,类型以及小分子对蛋白质二级结构的影响等信息,7,04,研究意义,深入了解复合物效应,小分子与靶部位的生物大分子作用后，将使后者,发生变化，由于这种变化而引起一系列生物体内的物理变化或化学变化，最,

4、终体现为效应。可以简单地理解为外源性小分子与生物大分子相互作用的整,体应答,理解作用机理与过程,小分子与生物大分子间非共价键的作用,对其,本质的研究,有助于理解在食品科学、生命科学、医学、药学领域中涉及到,的分子之间的相互作用以及相互识别过程,实际应用,食品中大分子与小分子的相互作用，使其理化性质发生一定的,改变，利用其可进行蛋白质、多糖的改性、核酸的修饰，以满足在食品研,究领域中的分析鉴定需要乃至生产加工需求,8,02,光谱学技术探究食品中的,大小分子互作用,PART TWO,9,07,前表面荧光技术,前表面荧光方法是将入射光与样品成,30,或,56,只对比色杯表面一层的,待测物质进行检测，

5、样品的光照面较大，可减少样品位置的敏感性，适,用于不透明的样品，省去了很多对样品前处理的步骤，适用于快速检测,同步荧光光谱技术,同步荧光技术是在同时变化激发和发射波长的情况下进行扫描，由测得,的荧光强度信号对发射或激发波长作图，即为同步荧光光谱,三维荧光光谱技术,三维荧光光谱能较完整地表达研究体系的荧光信息，三维荧光等高线图,具有指纹性，利用这些光谱信息结合化学计量学技术可完成多组分混合,物体系中较为复杂的定量与定性分析任务,但是，获取三维荧光光谱的,时间较长,分子荧光光谱法,10,10,食品中大分子与小分子的相互作用,岩藻黄素,乳清蛋白,荧光光谱扫描,吸收光谱扫描,红外光谱扫描,岩藻黄素对乳

6、清蛋白内源荧光的影响,进一步确定岩藻黄素对乳清蛋白的淬灭机制,确定乳清蛋白在岩藻黄素添加前后的二级结,构变化,例：探究岩藻黄素与乳清蛋白的相互作用,Food Hydrocolloids, 2017, 63:391-403,11,11,结果,表明，岩藻黄素能够减少乳清蛋白荧光团的,量子产率，引起乳清蛋白内源荧光的淬灭,通过扫描淬灭前后乳清蛋白紫外吸收光谱的,变化，确认蛋白质,配体复合物的形成。通,常，动态淬灭仅影响荧光分子的激发态，对,吸收光谱不会产生影响，而静态淬灭会导致,荧光分子吸收光谱的变化,吸收光谱的差异证实了岩藻黄素对乳清蛋白,的淬灭过程遵循静态淬灭机制,12,12,结果,使用同步荧光

7、、三维荧光和,FT-IR,对乳清蛋白结合岩藻黄素后的构象变化做进,一步研究,同步荧光可以提供关于发色团附近的环境信息,随着岩藻黄素添加到,BSA,中，可观察到,= 15,nm,同步荧光峰轻微红移，说明岩藻黄素可以扰,乱,BSA,中,Tyr,残基的微环境，发生从非极性到微极,性的转变,三维荧光技术可以全面展示生物大分子的内,源荧光信息，使构象研究更加科学可信,峰,2,ex = 230 nm,主要代表了,C=O,多肽链,骨架结构的荧光行为。这个峰的减少表明纳,米复合物的形成导致乳清蛋白骨架松弛，发,生解折叠，进一步表明岩藻黄素与乳清蛋白,多肽链中氨基酸残基存在相互作用,13,13,红外光谱,为了进

8、一步验证结合岩藻黄素后乳清蛋白发生的解折叠，通过,红外自解卷积,分析了,BSA,结合岩藻黄素前后,二级结构的变化,14,14,圆二色谱,circular dichroism, CD,圆二色谱法,circular,dichroism, CD,是通,过测定不对称分子对,左、右圆偏振光吸收,的不同来进行结构分,析，其在远紫外区,180-250nm,和近紫外区,250nm,可见光）的谱,图提供了蛋白质二级结构和三级结构的信息。目前被广泛应用于,大分,子的结构与功能的研究以及配基,小分子或大分子药物,与它们的相互,作用研究中,15,15,圆二色谱,circular dichroism, CD,16,16

9、,CD signal of a protein depends on its,second structure,17,17,圆二色谱,circular dichroism, CD,近紫外,CD,谱可作为一种灵敏的光谱探针，反映,Trp,Tyr,和,Phe,及二硫键所处微环境的扰动，能用来研究蛋白质三级结,构精细变化,VIP,近紫外,CD,光谱测量所需蛋白质溶液的浓度一般比远紫,外,CD,测量高,1,2,个数量级,18,18,蛋白芳香族氨基酸残基微环境,蛋白质中芳香氨基酸残基，如色氨酸,Trp,酪氨酸,Tyr,苯丙氨酸,Phe,及二硫键处于不对称微环境时，在近紫,外区,250,320 nm,表现

10、出,CD,信号,溶剂的选择一定要尽,可能的避免溶剂在考,察的波长范围内有吸,收值,19,19,微量热泳动仪,MST,微量热泳动仪是近年来刚兴起的一项技术,2010,年底的一篇,Nature,的文章,最先报道,了,NanoTemper,公司创始人,Dr. Stefan,和,Dr. Philipp,使,用,MST,测量生物溶液中蛋白,蛋白之间的相互作,用，引起了很多科研人员的极大兴趣,Nature communications,1 (2010): 100,20,这项技术基于生物分子的热泳动，微量热泳动仪使用红外激光,进行局部加热导致分子定向移动，导致发生相互作用的生物分子,的水化层、分子大小、电荷

11、等分子性质发生改变，进而引起反应,体系中荧光分布的变化，以检测相互作用的生物分子间的亲和性,特点,MST,将荧光检测的精准性与热泳动的灵活性及灵敏度,结合起来，快速、可信地检测分子间相互作用。相互作用的过程,可以在天然条件下，无需固定、任何生物溶液中完成测量,也可,以认为是一种光谱学技术,MST,是一种分析生物分子相互作用的新技术,20,21,03,PART THREE,热力学技术探究食品中的大小,分子相互作用,22,22,等温滴定量热仪,ITC,ITC,是一种检测由结合成分添加而起始的,任何化学反应的热力学技术，即一种反应,物滴加另一种反应物,测定反应体系温度,的变化,准确,原位,无损伤,地

12、同时提供热力学,和动力学信息,在,一次试验,中,ITC,可以测定大分子与小,分子之间,结合的,亲和力常数,K,结合反应中的,焓变,和,熵变,H,S,相互作用,化学计量结合位点数,23,23,24,24,独特特点,1,对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即,具有非特异性的独特优势,2,样品用量较少,方法的灵敏度和精确度高（最小检测热效应,0.125uJ,最小,用量,0.4ug,温度范围,2,80,3,实验时间较短,典型时间,30-60min,；对样品无破坏,应用范围,1,量化结合亲和力,2,候选药物的选择与优化,3,测定热力学特性和活性浓度,4,作用机制表征,5,在小分

13、子药物发现过程中确认预期结合靶标,6,测定结合特异性和化学计量,7,验证从苗头化合物到先导化合物演化过程中的,IC50,值和,EC50,值,8,酶动力学测定,25,25,食品中应用实例：酪蛋白与单宁酸的相互作用,Food Hydrocolloids,75(2018), 81-87,如图是典型的,ITC,数据图,配体溶液单宁酸通过,20,次注射到,ITC,池中的酪蛋,白溶液中，我们可以看到每个注射峰（上图）所显,示的数值即为体系所进出的热量，负值可以证明整,个反应是放热的,同时，如此明显的焓变也说明蛋白,质与单宁酸之间发生了某种相互作用,此外，通过机器分析我们可以得到以下基本信,息,N,值,代表

14、结合位点数：说明平均,0.968,个单宁酸,分子与一个酪蛋白分子相结合,K,值,代表结合常数表明的二者之间结合能力的,大小为,6.32 * 10,4,M,H,代表反应涉及的焓变,6.167cal/mol,S,代表反应涉及的熵变,19.5 cal/mol/deg,同时均为负值的焓变与熵变说明二者直接的结,合通过弱相互作用进行，并主要对应于范德华,力和氢键,26,04,分子模拟其他相关技术,27,27,1,分子模拟,分子模拟是指通过现代计算机强大的数据处理和图形显,示功能，在计算机上对分子体系及其相互作用进行计算,模拟、分析，从而解释已有实验现象，或为新的研究提供,指导和预测,其理论基础是量子力学

15、,Quantum Mechanis,QM,分子力学,Molecular Mech,anics,MM,以及量子力学,分子力学杂合方法,QM,MM,28,28,1.1,岩藻黄素与乳清蛋白自组装的分子模拟,London N, Miller R M, Krishnan S,et al,Nature,Chemical,Biology,2014,Dror R O, Green H F, Valant C,et al,Nature,2013,BSA,La,Lg,29,29,BSA,Lg,La,BSA,Lg,La,对接自由能,kJ mol,1,模,型,G,bin,ding,G,vdW+hb,desolv,G,

16、e,lec,G,i,ntern,G,t,or,G,unb,G,e,xp,BS,A,29,26,47.65,1,55,8,53,19,94,8,53,27,58,Lg,22,65,41.17,1,42,2,97,19,94,2,97,22,58,La,23,62,42.89,0,67,8,11,19,94,8,11,22,51,氢键,氢键,分子对接,对接构象与能量,Food Hydrocolloids,63 (2017) , 391-403,30,30,分子动力学模拟,回转半径、二级结构,蛋白质回转半径,R,g,蛋白质二级结构组成变化,回转半径代表蛋白紧密程度，结合岩藻黄素后，乳清蛋白回转半径减小，表明结,构变得松散,主要二级结构比例减少，表明乳清蛋白发生了部分解折叠,Food Hydrocolloids,63 (2017) , 391-403,31,31,1,原子力显微镜,AFM,牛血清蛋白和金丝桃苷相互作用前后：蛋白质发生聚,集，粒径增大,Food Hydrocolloids,75(2010), 21-31,2,电位粒度仪,ZS90,微电泳技术及动态光扫描技术,测量大分子结合小分子前后的水合半径、分子表面,电势的变化,3,核磁共振波谱技术,NMR,核磁在解析大分子三维结构上有独特的优势，因此近年来在小分子与大分子,相互作用方面也有应用，但是由于核磁对样品要求