实验三质粒的提取与电泳

1、实验三,质粒提取与电泳,实验目的,通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法,实验原理,碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH值4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此，复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此己完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色

2、体DNA分子与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去,仪器、材料与试剂,一) 仪器 1.恒温培养箱 2.恒温摇床 3.台式离心机 4.高压灭菌锅 5.电泳仪、电泳槽 6.分光光度仪 7.凝胶成像系统,二) 材料 1.葡萄糖 2.三羟甲基氨基甲烷（Tris） 3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4.氢氧化钠 5.十二烷基硫酸钠(SDS) 6.乙酸钾 7.冰乙酸 8.氯仿,9. 乙醇 10胰RNA酶 11氨苄青霉素 12蔗糖 13溴酚蓝 14酚 15. 含pUC19质粒的大肠杆菌 16吸头、小指管,三) 试剂 1. 溶液I 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L 三羟甲

3、基氨基甲烷（Tris）TrisHCl (pH8.0) 10 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA) (pH8.0) 2. 溶液II 0.4 mol/L NaOH, 2% SDS, 用前等体积混合 3. 溶液III 5mol/L 乙酸钾 60 mL 冰乙酸 11.5 mL 水 28.5 mL,4. TE缓冲液 10 mmoL/L TrisHCl (pH8.0) 1 mmoL/L EDTA (pH8.0) 5. 70%乙醇 (放-20冰箱中,用后即放回) 6. 胰RNA酶 将RNA酶溶于10mmoL/L TrisHCl(pH7.5)、15mmoL/L NaCl中, 配成10mg/mL的浓度, 于1

4、00加热15min, 缓 慢冷却至室温,保存于-20。 7. 凝胶加样缓冲液（6X）：40%蔗糖、0.25%溴酚兰,实验步骤,1. 将2 ml含相应抗生素（Amp：50g/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入上述的含pUC19质粒的大肠杆菌，37振荡培养过夜。 2. 取1.5 mL培养物倒入微量离心管中，4000 r/min离心2min。 3. 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。 4. 将细菌沉淀悬浮于100L溶液中 (此处可加5L 浓度为10g/L RNase A处理RNA，在后面TE中就不必加RNase A), 充分混匀，室温放置10 min,5. 加200L溶液（新鲜配制），盖紧管盖

5、，混匀内溶物，将离心管放冰上5 min。 6. 加入150L溶液（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置15 min。 7. 12000 r/min离心15min，将上清转至另一离心管中。 8. 向上清中加入等体积酚:氯仿（1:1）或氯仿:异戊醇(24:1)（去蛋白），反复混匀，12000 r/min离心5 min，将上清转移到另一离心管中,9. 向上清中加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置510 min。12000 r/min离心5 min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 10. 用1 mL 70乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。 11. 加50L TE缓冲液，(其中含有20g/mL的胰RNA酶)，使DNA完全溶解，-20保存。 12. 紫外分光光度计测定DNA样品浓度(1L DNA + 49L H2O)。 13. 电泳检测DNA样品(1-2L DNA + 1L loading buffer + 3-4L H2O,