实验巨噬细胞酸性磷酸酶显示

1、实验八、巨噬细胞酸性磷酸酶显示,组织化学（histochemistry）和细胞化学（cytochemistry,是在组织切片上或被检材料上，加一定试剂，使它与组织或细胞中待检物质发生化学反应成为有色沉淀物，以用光镜观察，若为重金属沉淀，可以用电镜观察，称电镜组织化学（electron microscope histochemistry)。这种方法可用于检测细胞内的酶类、糖类、脂类、核酸与某些金属元素等。如进一步应用显微分光光度计等测定标本中沉淀物的强度，则能较精确地进行定量研究,1. 糖类显示法,最常用的显示方法是过碘酸-雪夫反应（periodic acid Schiff，PAS反应)。 基本

2、原理是：糖被强氧化剂过碘酸（HIO4)氧化后，形成2-醛基；后者与Schiff试剂中的无色品红亚硫酸复合物结合，形成紫红色反应产物,PAS反应阳性部位即表示多糖的存在,2. 酶类显示,酶的显示法是通过显示酶的活性来表明酶的存在，而不是酶的本身。 将具有酶活性的组织放人含有一定底物的溶液中孵育，底物经酶的作用形成初级反应产物，它再与某种捕捉剂相反应，形成显微镜下可视性沉淀，即最终反应产物,3脂类显示,脂类物质包括脂肪与类脂。 标本可用甲醛固定、冷冻切片、用油红、苏丹、苏丹、苏丹黑B、尼罗蓝等脂溶性染料染色；亦可用锇酸固定兼染色，脂类呈黑色,4核酸显示法,显示DNA的传统方法为Feulgen反应。

3、 切片DNA经弱酸(1mol/LHcl)水解,其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开,使脱氧核糖的一端形成游离的醛基,这些醛基在原位与Schiff试剂(无色品红亚硫酸钠溶液)反应,形成紫红色的化合物,使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应.紫红色的产生,是由于反应产物的分子内含有醌基,醌基是发色团,因此具有颜色. 如用甲基绿-派若宁反应，可同时显示细胞内的DNA和RNA。 甲基绿与细胞核中的DNA结合呈蓝绿色，派若宁与核仁及胞质内的RNA结合呈红色,酸性磷酸酶显示实验原理,酸性磷酸酶能分解磷酸脂（常用-甘油磷酸钠）而释放出磷酸基。在pH50的环境中，磷酸基能与铅盐（硝酸铅，捕捉剂）反应形成无色的

4、磷酸铅（微细沉淀，可在电镜下观察），再经过与硫化铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀（可在光镜下观察），以此显示酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布,实验材料,小鼠腹腔液涂片（重点观察巨噬细胞,实验试剂及用品,1、6淀粉肉汤 牛肉膏 03g 蛋白胨 1.0g 氯化钠 05g 可溶性淀粉 6g 蒸馏水 100ml 高压灭菌99104pa(15磅)20min 2、10中性福尔马林(pH6871) 甲醛 10ml 蒸馏水 90ml 醋酸钠 2g,3、酸性磷酸酶作用液 配方： 蒸馏水 90ml 02molL醋酸缓冲液(pH46) 12ml 5硝酸铅 2ml 3.2甘油磷酸钠 4ml 配法：先将蒸馏水和醋酸缓冲液混

5、合，随后分成大致相等的两份，一份中加硝酸铅溶液，另一份加甘油磷酸钠溶液，然后再将两者缓缓混合，边混边搅匀。 若pH不到50，可加少量醋酸的调整。注意：配好后的作用液应透明无絮状悬浮物和沉淀； 最好在临用前配制，不能贮存。 附：02molL醋酸缓冲液（pH46）配制方法 0.2mol/l醋酸（ml） 25.5 0.2mol/l醋酸钠（ml）24.5,4、1硫化铵溶液 硫化胺 1ml 蒸馏水 9ml 5、姬姆萨染液（1：30） 姬姆萨原液 3滴 磷酸盐缓冲液（pH68） 5ml,实验方法,1、巨噬细胞诱导：实验前2天开始，每日向小鼠腹腔注射6淀粉肉汤1ml，连续注射3天。 2、收集巨噬细胞： 在第

6、三天注射后34h，再向腹腔注射生理盐水1ml，过3min后抽取腹腔液。 3、粘附：将腹腔液滴在预冷的载玻片上，每人2片，每片23滴，将玻片水平放到冰箱内（4），让细胞自行铺展、粘附30min。 将其中1片样品置湿盒内放50温箱中30min，使酶失活 4、固定：将玻片插入盛有10中性福尔马林（已预冷）的染色缸内，冰箱内4固定30min。 5、自来水漂洗5min，将水甩干,6、加足量酸性磷酸酶作用液覆盖样品，放37水浴箱中反应30min。 7、自来水漂洗片刻。 9、在通风橱中加硫化铵反应10min。 10、自来水冲洗，甩干。 11、直接加PBS封片（或用130的Giemsa染液染色15min再封片,12、镜