动物模型的建立与应用

1、疾病动物模型的复制,定义：是生物医学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物 实验对象和材料。使用动物模型是现代科技中一种便于认识生命科学客观规律的实验方法和手段。人类疾病的动物模型的研究，实质上是比较医学的应用科学,在生物医学研究中应用动物模型是利用不同种类动物之间生物学现象的一致性。例如，我们希望测试在一种动物中存在的某个系统，将获得的知识外推到另一种动物，而模拟的目标通常为人类。研究的焦点不是所用动物的情况，而是这一动物生理学表现针对我们人类或其他动物种类的类推。因此，在这种情况下称“人类模型”将会更正确,动物模型的优点,避免了在人体进行实验所带来的风险，如增加痛苦 平时见不到的疾病可在动

2、物身上复制出，如急性放射病及 烧伤和冻伤等 可以克服人类某些疾病潜伏期长、病程长和发病率低的缺点 可以严格控制实验条件，增强实验材料的可比性 又助于更全面认识疾病的本质,动物模型设计原则： 相似性：复制模型应尽可能近似人类疾病，最好能找到与人类疾病相同的动物自发性疾病。如大鼠自发性高血压、小型猪自发性冠状动脉粥样硬化。 重复性：理想的模型应是可重复、可标准化的。应尽量选用标准化LA、标准化实验设施、标准化饲养管理、标准化实验操作,可靠性：复制模型应特异地、可靠地反映该种疾病或某种 机能、代谢、结构变化，同时应具备该种疾病的主要症状和体征，并经受一系列检测得以证实。 适用性和可控性：复制模型应尽

3、量考虑今后临床能应用和便于控制其疾病的发展，以利于开展研究工作。 易行性和经济性：满足实验需求的前提下尽量使用低成本实验动物，实验技术方法可行,医学动物模型的分类 按产生原因分类 诱发性动物疾病模型：是指通过使用物理、化学、生物等致病 手段，人为地造成动物组织、器官或全身形成人类疾病动物模 型，在功能、代谢、形态结构等方面有所改变，即人为地诱发 动物产生类似人类疾病模型。 主要用途：药理学、毒理学、免疫学、肿瘤和传染病等,优 点：制作方法简便，实验条件比较简单，其他因素容易控制，短时间内可复制大量的动物模型 不足之处：诱发的与自然产生的在某些方面有所不同。而且有些人类疾病不能用人工方法诱发出来

4、，有它的局限性,特别提示 大多数诱发性疾病模型是部分性或同形性模型，因为即使以相同的致病因素作用于动物，所获结果通常与人类对应的疾病也不尽相同。几乎没有诱发性疾病模型能够完全模拟人类相应疾病的病因、病程和病理。 诱发性疾病模型的关键是诱发性疾病（或异常）的病理和结果与模拟人类疾病的情况相似。人类SARS冠状病毒可以致恒河猴发病，但是其病变严重程度要明显轻，疾病的结局也显然不同,药物性糖尿病模型链脲佐菌素STZ 诱发性动脉粥样硬化模型高脂饲料诱导 豚鼠支气管痉挛模型 组胺诱导,自发性动物模型：指不加任何人工诱发，在自然条件下动物 自然产生的疾病，或者由于基因突变的异常表现通过遗传育 种保留下来的

5、动物疾病模型。其中包括近交系的肿瘤疾病模 型和突变系的遗传性疾病模型。突变系的遗传性疾病很多， 可分为代谢性疾病、分子性疾病、特种蛋白合成异常性疾病等，如裸鼠,现在已经记载和保存了数百个具有模拟人类相似疾病状态的遗传性异常的品种和品系（） 典型例子： 自发性高血压大鼠 裸小鼠,自发性疾病模型的特点 自发性疾病模型通常是同源性模型，动物疾病的表型表现与相应的人类疾病相似。这种表型的相似性通常扩展到模型动物对治疗的反应与人类患者相似。自发性动物模型在人类疾病治疗方案的研发方面已经起到重要作用。 近交系小鼠的基因突变由于它们同时拥有相应的同类系或同品系，从而提供了优

6、异的对照。因为近交系小鼠的疾病通常为一个受累基因或部位产生了变异，可同时研究与这些突变小鼠相同的遗传背景的参照品系,特别提示 受损的基因或基因序列常常导致其他基因的激活，从而动员代偿代谢机制。这些代偿机制人类和动物模型之间可能不同。 多数情况下，具有自发性疾病的近交系动物的保种和繁殖困难，价格较贵。 有些自发性疾病模型不便于应用。例如，利用近交系动物自发性肿瘤模型进行治疗研究，常常要观察1年才有肿瘤发生，而且肿瘤发生的时间、种类和发生部位在个体之间常不一致，往往难于确诊和判定治疗效果,基因工程动物模型：指某些遗传性状通过基因工程手段而被人为改造的动物。以对动物改造的手段不同可将其分为三种类型：

7、 转基因动物（transgenic animal） 基因敲除动物（gene knock-out animal） 基因替换动物（gene knock-in animal,转基因动物：通过实验手段将新的遗传物质导入到动物胚胎细胞中，并能稳定遗传，由此获得的动物称为转基因动物。 基因敲除动物：通过基因工程手段将已知基因去除，或用其他顺序相近基因取代，而获得的工程化动物。通常针对一个结构已知但功能未知的基因，通过观察基因敲除动物的情况，推测相应基因的功能。 基因替换动物:与某个生理现象相关的两个基因中,一个基因的编码区被另一个基因的编码区所替代的工程化小鼠,基因工程动物模型的特点 可按照研究目的进行设

8、计和培育，其建立过程的本身就可进行疾病机制的研究。 不但能从动物整体水平和组织器官水平上进行研究，而且还可以深入到细胞水平和分子水平，为发病机制、药物筛选和临床医学研究提供了比较理想的实验体系。 转基因动物技术克服了物种之间的生殖隔离，实现了动物物种之间遗传物质的交换和重组,特别提示 从理论上讲，随着遗传工程的发展，已有可能在体外培育的哺乳动物细胞中对任何一个或几个已知基因组结构和DNA序列的位点进行各种类型的遗传修饰。 基因调控机制十分复杂，目前基因工程动物模型提供的信息还很局限。例如，利用转基因小鼠的研究证实除了单一的癌基因可以引起肿瘤外，癌基因之间的协同作用也可能导致肿瘤的发生。即导入一

9、个癌基因可能会激活另一个癌基因，从而导致了特异性肿瘤的发生,阴性疾病模型 Negative disease models 阴性疾病模型是指不能复制某些疾病的动物品系或品种。例如，感染性疾病模型通常局限于有限的敏感动物，而其余的不反应动物种类可看作是这一特殊人类病原微生物的阴性模型。阴性模型因此也包括表现对特定刺激缺乏反应的动物。这类模型主要应用于探讨动物生理上对致病因素进行抵抗的机制. 哺乳类动物均感染血吸虫病 而东方田鼠却不感染血吸虫病,孤立动物模型 Orphan disease models 孤立动物模型是指某种疾病最初在一些动物身上发现并被研究，但到目前为止在人类自身体内无法证实。包括：

10、马立克氏病（Mareks disease）, 多发性乳头瘤（Papillomatosis）, 牛海绵状脑病（bovine spongiform encephalopathy）, 绵羊脱髓鞘性脑白质炎（Visna virus in sheep）, 猫白血病病毒感染（feline leukemia virus,从动物到人类的外推 对动物实验结果不加批判地应用是危险的。在动物体内无毒或无效的药物在人类体内可能有毒或有效，反之亦然。 人类在遗传上是高度变异的，同时伴随着文化、饮食和环境的差异。很多实验动物在遗传变异性上与人类不同，尤其对于药理学和毒理学模型可成为重要因素,免疫缺陷动物,第一节 免疫缺陷

11、动物的分类及其特点,常用模型动物简介,免疫缺陷动物是指由于先天性遗传突变或用人工方法造成一种或多种免疫系统组成成分缺陷的动物,1962年 苏格兰Grist首先发现无毛裸鼠 1968年 Pantelouris发现裸小鼠无胸腺 1969年 丹麦Rygaard首次成功将人类恶性肿瘤移植于裸小鼠体内，肿瘤存活并生长。 70年代后期我国开始引进裸鼠,免疫缺陷动物的分类,先天性免疫缺陷动物： T淋巴细胞功能缺陷动物 裸鼠 B淋巴细胞功能缺陷动物 CBA/N小鼠 NK细胞功能缺陷动物 Beige小鼠 联合免疫缺陷小鼠 SCID小鼠 获得性免疫缺陷动物模型 小鼠AIDS模型 猴AIDS模型 黑猩猩的HIV感染

12、模型,一 、 裸小鼠,1、无胸腺裸小鼠，含有隐性突变基因nu，位于11号染色 体。 BALB/c-nu， NIH-nu，C3H-nu，C57BL/6-nu。 2、特征：（ 1 ）毛发生长异常，全身无毛（2）无胸腺， T细胞不能正常分化，缺乏成熟的T细胞的辅助、抑 制及杀伤功能，不能执行正常T细胞功能（3）B细胞 功能正常，较高的NK细胞活性,3、应用,在微生物学方面：研究病毒和细菌感染机制的极好模型动物。裸鼠对麻风杆菌高度易感。 在免疫学方面：可有效研究淋巴细胞的功能。裸鼠不排斥杂交瘤，腹水产量高，效价高。 在寄生虫学方面：可用于多种寄生虫感染模型的研究，如复制卡氏肺囊虫模型。 在遗传学方面：

13、裸鼠的遗传因素、免疫缺陷指标及组织学特征均与人类免疫缺陷病相似，是研究这些疾病的发病机理和遗传规律的重要模型。 肿瘤学方面: 制备人体肿瘤移植模型,二、裸大鼠,1、1953年由英国人Rowett首先发现，基因符号为rnu，具有与裸小鼠相似的特征，无胸腺，缺乏功能性T淋巴细胞，B细胞功能正常，NK细胞活力增强 2、体毛稀少，有时暂时完全消失， 以后又复现，躯干仍有稀少背毛。 3、抵抗力差，易患溃疡性气管炎 及化脓性支气管肺炎等呼吸道疾病,4、发育相对迟缓，其体重只有正常大鼠的70%。 5、雌性大鼠繁育能力低。 6、能接受人类正常组织和肿瘤的异种移植，由于其体形大，可提供足够的血样进行血液学和血清

14、生化分析实验,三、性连锁免疫缺陷小鼠（X-linked immune deficiency mouse ,XID,1、CBA/N小鼠，B细胞功能缺陷,基因符号Xid，位于X性染色体 2、纯合雌鼠和杂合雄鼠对非胸腺依赖性II型抗原没有体液免疫 反应，血清中IgG和IgM含量降低，其T细胞功能正常。 分泌IgG和IgM的的B细胞数量减少 3、该模型是研究B淋巴细胞的发生、 功能与异质性理想的动物,四、Beige小鼠,1、为NK细胞活性缺陷的突变系小鼠，bg是隐性突变基因，位于13号染色体。纯合的小鼠被毛完整，但毛色变浅。 2、内源性NK细胞功能缺乏，是由于细胞溶解作用的识别过程受损所致。纯合的bg

15、基因同时还损伤细胞毒T细胞功能，降低粒细胞趋化性和杀菌活性,3. bg基因影响溶酶体的发生过程，导致溶酶体膜缺损，由于溶酶体功能缺陷，bg对化脓性细菌感染非常敏感，对各种病原因子也较敏感。这种小鼠要在SPF环境中才能较好地生存，繁殖采用纯合子交配,五、严重联合免疫缺陷小鼠（Severe combinedimmunodeficient mice，SCID,1. 1983年由美国学者Bosma首先发现于C.B-17近交系小 鼠，位于16号染色体的scid的单个隐性突变基因所致。 2. 纯合scid基因导致编码免疫球蛋白重链（IgH）和T细胞抗原受体基因（TCR）V-D-J基因重排异常，抑制B细胞和

16、T和T细胞前体的正常分化，造成T、B淋巴细胞自身不能分化成特异性功能淋巴细胞， 循环中免疫球蛋白减少或缺损,C.B-17小鼠是BALB/cAnIcr小鼠的同源近交系，差别在于该小鼠携带了C57BL/ka小鼠的免疫球蛋白重链Igh-1b等位基因. C.B-17小鼠的遗传背景与BALB/cAnIcr基本相同，其H-2抗原均为H-2d. 此外目前已有C3H-SCID等其他品系遗传背景的SCID小鼠出现,3、SCID小鼠外观与普通小鼠无异，胸腺、脾和淋巴结的重量不及正常的30%，组织学上为淋巴细胞显著缺乏。 胸腺为脂肪组织包裹，没有皮质结构，主要由类上皮细胞和成纤维细胞构成。 脾白髓不明显，脾小体无淋

17、巴细胞聚集，主要 由网状细胞构成。淋巴结无明显皮质区，呈淋巴细胞脱空状。小肠粘膜下和支气管淋巴结较少见，无淋巴细胞聚集。其外周血白细胞较少，淋巴细胞占白细胞总数的10-20%，而正常小鼠应占70,4. SCID小鼠所有T和B淋巴细胞功能测试均为阴性，对外源抗原无细胞免疫及抗体反应。NK细胞功能 正常，巨噬细胞、粒细胞和红细胞等呈正常状态. 5. 渗漏：大部分SCID小鼠缺乏功能性淋巴细胞，但少数SCID小鼠在饲养过程中可出现极少程度的免疫功能恢复，即约有15%的SCID小鼠血清中可检测出免疫球蛋白，这与小鼠的年龄、品系和饲养环境有关,许多人类寄生虫不能感染其他小鼠，而SCID小鼠不但可被人类丝

18、虫病所感染，而且所出现的病变也与人类相似. SCID小鼠肿瘤移植存活率高达36.9%,一般裸鼠为16.8%,对白血病和恶性肿瘤不但转移率高,而且能广泛扩散,与人体肿瘤生物学行为极为相似,其侵润和转移与人类肿瘤自发转移相似. SCID小鼠是研究淋巴细胞分化作用和调控作用的主要模型,也是研究免疫缺陷与自发淋巴瘤之间关系的主要模型,目前已有将T细胞性白血病细胞，B 细胞性白血病细胞，髓细胞性白血病细胞移植于SCID小鼠后，癌细胞在其骨髓，胸腺，脾等造血器官及非造血器官中(包括中枢神经系统)增生扩散的报道，其病理过程与白血病病人的临床过程相似。 北京医科大学王顺和将人肺腺癌PG和PGTS细胞移植到SC

19、ID 小鼠，所有动物均见肿瘤生长，其移植成功率为100，并显示肿瘤细胞的侵袭及转移，表明SCID小鼠亦为研究PG及PGTS细胞的良好模型,六、Motheaten小鼠,1.突变基因（me）位于第6对染色体，出生后2d可出现皮肤脓肿 2.有严重联合免疫缺陷，表现为对胸腺依赖和不依赖抗原均 无反应，对T、B细胞分裂素的增殖反应严重受损，细胞毒和 NK细胞活性降低。 3.纯合型伴有自身免疫的倾向，是自身免疫性疾病的良好模型,七、人工培育的先天性联合免疫缺陷动物,1. 将3种小鼠的3个隐性突变基因即Beige基因、T细胞缺陷的 nu基因以及B细胞缺陷的xid基因经过杂交、筛选及导入，育成T、B、NK细胞

20、三连缺陷的Beige-nude-xid小鼠。 2.表型为裸鼠，皮肤清淡呈苍白色，虹膜睫状体和脉络膜色素变浅，并形成了一个深色颗粒的色素环，以及无肉眼可见的胸腺，出血时间延长,第二节 人体肿瘤裸鼠移植模型概述,一、人体肿瘤异种移植的历史 1.同种鼠移植成功率高，异种鼠体内不能生长 2.移植于动物免疫抑制或免疫反应迟发的特殊部位:地鼠颊 囊、鸡胚或豚鼠的眼前房 3.使用免疫抑制剂全身照射 4.1969年Rygaad和Povlson首次将人结肠癌在裸鼠移植成功. 目前有400多种 5.1979年引进裸鼠，1982年上海第一医院首次报道人肝癌裸 鼠体内移植成功，目前已有40多种,6. 肿瘤转移模型 北

21、京医科大学病理学教研室，吴秉铨等曾研究出高转移肺巨细胞癌系PG裸鼠的移植模型，皮下接种淋巴细胞转移率可达100，肺转移为83，长期传代高转移特性不变 Nakanish等将一例分化程度较差的人胃髓样癌移植于裸鼠的皮下及肌肉，获得肺转移率100的转移模型，建立了一株裸鼠体内的人胃癌高转移模型,二、人体肿瘤裸鼠移植瘤的生物学特征,1) 保持原发瘤的病理形态学、染色体特征、肿瘤标记物 等特点。 (2) 多数肿瘤呈结节状生长，周围有膜包裹，极少可有局部 侵润和远处转移，其组织形态、超微结构等均保持移植 前肿瘤的特征。 (3) 传代的移植瘤能保持肿瘤的机能。如原发肿瘤的分泌特 性。AFP，HBsAg，CE

22、A,4)裸鼠不能再现人体原发瘤的全部特征及其遗传学上的不 稳定性 人体原发瘤的的所有细胞亚群不能全部出现在移植瘤中，出现异质性。 一些生物学特性的丢失。 出现了原发瘤中并不存在的细胞亚群,5）裸鼠对移植瘤的反应,丧失原有间质，而获得小鼠间质 当肿瘤生长时，原发肿瘤的间质退化，由宿主产生新的 移植瘤间质。 间质可引起癌组织本身分化程度的差别及发生化生的可 能。如裸鼠的结缔组织可以增生和分化为软骨和骨Ewing 肉瘤可以诱导裸鼠产生新生骨,体内和体外研究互补配合进行观察 利用动物模型可进行药物筛选 在动物体内进行连续传代后的肿瘤细胞，在体外培养中也易获得长期生存，可提高培养的成功率,6）裸鼠移植瘤

23、的评估,三、裸鼠肿瘤移植模型具有的优点,1.裸鼠体内免疫缺陷机制恒定，其它鼠类需另加去免疫措施，其条件恒定性受个体差异的影响。 2.可以控制肿瘤的致癌性，使人体肿瘤移植后良好生长 3.接种成功的瘤组织具有原肿瘤的结构特点，有利于体外培养的瘤细胞株的鉴定 4.研究肿瘤在体内的生长行为与过程，探讨肿瘤与宿主免疫间的相互关系,四、裸鼠肿瘤移植模型缺点,不能完全接受异种移植物，例如人体肿瘤和淋巴组织，而且不同起源的人肿瘤在裸鼠身上的可移植性差异很大,第三节、人体肿瘤裸鼠移植瘤模型的建立方法,1、裸鼠的繁育 母性差，选用雄性裸鼠与半裸雌鼠交配。 2、裸鼠的饲养条件：SPF环境 隔离器，超净层流架，SPF

24、级洁净饲养室,人体肿瘤裸鼠移植方法,一）移植肿瘤的常规处理及移植方法： 1、组织块移植法：新鲜的手术标本切成3-6mm3 接种 2、悬液移植法：大批量接种实验 3、培养细胞法：对数生长期的细胞106-107 /0.2ml,二）不同移植部位,1、腹水瘤的建立及移植方法：将实体瘤细胞悬液注入裸鼠腹腔，可形成腹水，用于定量移植，早期为血性后为乳白色，若将腹水细胞注入皮下可形成实体瘤 2、肾包膜移植：可将人癌组织移植于正常非免疫抑制小鼠肾包膜，癌组织成活6d。用于体内抗癌药物的筛选 3、原位移植：将人体肿瘤细胞移植于与肿瘤原发部位相同的裸鼠脏 器内，如将肝癌移植于裸鼠的肝,影响人体肿瘤裸鼠移植的因素,

25、1、人体肿瘤细胞本身的特征： 人手术标本裸鼠移植成功率为28.3%,其中复发瘤为50%,转移瘤为38.5%,而原发瘤仅为20.5%. 黑色素瘤和结肠癌的移植成功率高,而腺癌和造血系统肿瘤移植成功率低. 用已建株的癌细胞系移植成功率高于用人癌手术标本移植,2、裸鼠的免疫状态： 裸鼠体内NK细胞和B细胞活性正常，可采用免疫抑制剂、射线照射等措施降低动物的免疫功能。 采用联合免疫缺陷动物。 3、移植部位和途径： 皮下接种时，以接近头侧的成功率高，通常为腋下。一般不发生转移和侵袭。 肾包膜接种成功率高于皮下。 腹腔接种产量高，较易显示癌细胞的侵袭和转移力。 原位接种，成功率高，生物学行为和药物动力学更

26、接近人体的原发瘤,4、激素和宿主性别： 依赖雌激素的乳腺癌接种于正常雌性裸鼠上生长较慢，接种到雄性裸鼠上生长则更慢。PC82人前列腺癌可在雄性裸鼠中连续传代，而不能在雌性裸鼠中长出肿瘤。 5、鼠龄： 与成年（6-8周龄）的裸鼠相比，移植在幼年或新生裸鼠体内的肿瘤更易生长和转移。这与不同龄鼠NK细胞活性不同有关,6、裸鼠的健康及洁净状况： 洁净度越高，外界抗原越少，裸鼠的NK细胞活力越低，更适宜移植瘤的生长及转移的形成。 Kyriazis发现SPF级裸鼠皮下或腹腔接种106人喉癌细胞HEP-2均可成瘤，且可见皮下肿瘤侵袭包膜，腹腔接种呈明显侵袭和转移，但相同数量瘤细胞接种到肝炎阳性裸鼠身上，却未

27、发展成肉眼可见的瘤节。 一般认为裸鼠受病毒、细菌等感染，可增加抗原的刺激，从而影响NK细胞等非T细胞依赖性免疫活性,第四节 SCID-hu模型的建立极其在肿瘤学研究中的应用,一、SCID-hu小鼠模型的概述 将人外周血淋巴细胞和其他人体组织移植于SCID小鼠，使其具有人体的某些免疫学特征，称之为SCID-hu模型 可将自身免疫性疾病患者的淋巴细胞、脾细胞、胸腺细胞移植于SCID小鼠，鼠体内出现自身免疫性抗体，可出现相似于患者的自身免疫性组织学损伤。 在移植SCID小鼠人皮肤组织中接种黑色素瘤组织，观察人正常皮肤组织与瘤组织的相互作用,二、可移植的组织,1、胎肝、胎胸腺，胎儿骨髓和成年人外周血淋

28、巴细胞(PBL)，后者最常用，称之为hu-PBL-SCID。 2、特征：免疫重建小鼠体内存在各类lg，其外周血及淋巴器官中可检出人淋巴细胞,三、存在的问题,1、移植的SCID小鼠并非100%成功，不同小鼠之间个体差异较大，模型缺乏稳定性。 2、关于SCID小鼠体内的淋巴细胞是否具有功能，能否形成继发性或原发性免疫应答的结果存在差异。 3、重建的SCID小鼠，T细胞易获得免疫重建，但虽有高水平的lg在小鼠外周血中得以检测，活性B细胞的数目却极其有限，难以形成原发性抗体反应。 4、易发生移植物抗宿主反应导致小鼠死亡。 5、重建方法不统一，效果不同,四、有益的探索,移植物方面： Shiroki等以抗人CD3抗体、PWM处理及混合淋巴细胞培养等方法，先激活人淋巴细胞后再移植于SCID小鼠，hu-PBL-SCID小鼠的成功率达到86.7% Alegre以新鲜尸体脾细胞建立的hu-spl-SCID模型