诱导时机对羧肽酶原B包涵体质量及复性率影响探究VIP

1、诱导时机对羧肽酶原B包涵体质量及复性率影响探究 摘要：目的研究诱导时机对羧肽酶原B包涵体质量和复性率的影响，探讨包涵体质量评价体系。方法在不同时间诱导产生重组羧肽酶原B包涵体，研究其变性和复性、对蛋白酶K的稳定性及在一定浓度盐酸胍溶液中的化学变性，分析诱导时间与包涵体复性率的相关性。结果诱导时机不同，所得重组羧肽酶原B包涵体复性率及对蛋白酶K的稳定性不同，在一定浓度盐酸胍溶液中的溶解性也不同。复性率越高的包涵体越不易被蛋白酶K酶解，对化学变性剂的稳定性也高。结论诱导时机影响重组羧肽酶原B包涵体的质量及复性率。 关键词：羧肽酶B；诱导时机；包涵体；蛋白酶K 中图分类号：Q518.4文献标识码：A

2、文章编号： 1672979X(2009)07001704 随着基因工程和蛋白质工程的发展，现已能按照需要设计和生产具有各种特殊用途的蛋白质。其中难题之一是基因工程产物往往以没有生物活性的包涵体(inclusionbodies，IBs)形式存在。已知70以上的重组蛋白质在大肠杆菌中形成不溶的IBs，且大多数IBs蛋白质的复性率不超过10，有的甚至完全不能复性。减少IBs的形成数量或者提高IBs的复性率是基因工程和蛋白质工程亟待解决的问题。 研究表明，以IBs形式表达的重组蛋白质未必完全失去活性2IBs蛋白质的重要特点是存在二级结构和有抵抗蛋白质水解的能力3，4。如可溶性和IBs形式的半乳糖苷酶的

3、比活具有同样的数量级1；偶联了荧光蛋白的IBs荧光蛋白可发出高强度荧光，都证明IBs蛋白可以保持部分蛋白质的天然结构2。Groot等5用与帕金森症相关的A42肽偶联荧光蛋白研究了在大肠杆菌中表达蛋白质聚体的活性与培养温度的相关性，发现二者呈负相关。与之相反，温度升高有助于提高IBs应对化学变性或水解时的稳定性。 本课题组对重组羧肽酶原B进行了较系统的研究6，7。以重组羧肽酶原B为模型，研究了诱导时机对IBs质量和复性的影响。结合IBs复性率，对评价IBs质量的方法进行了初步探索，并由此得到了最佳诱导时机。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1菌株与质粒含有表达质粒pET21aproCPB的表达

4、菌株BL21(DE3)系本实验室保存。 1.1.2培养基LB液体培养液：1蛋白胨(Oxoid)，0.5酵母提取物(Oxoid)，1氯化钠；LB固体培养基另含有1.5琼脂。 1.2方法 1.2.1蛋白质表达和包涵体洗涤取表达菌株单克隆，转入含有100g/mL氨苄青霉素(ampicillin，Amp)的LB培养液中，37培养过夜，作为一级瓶。按2的接种量转入二级瓶(100g/mLAmp)培养，培养不同时间后分别加入终浓度0.5mmol/L异丙基D硫代半乳糖苷(isopropyDthiogalactoside，IPTG)诱导表达。加入诱导剂之前的培养时间称为诱导时机。从转入二级瓶到收菌的总培养时间为

5、12h。不同收菌时间是指在优化出最佳诱导时机后，从加入IPTG到收菌的表达时间。4000r/min离心30min，弃上清，菌体用pH8.0，浓度20mmol/L的TrisHCl悬浮，超声波破碎菌体，10000r/min离心15min，收集沉淀。用pH8.0含1TritonX100的20mmol/LTrisHCl洗涤，离心10min得沉淀，再用pH8.0，20mmol/LTrisHCl充分洗涤沉淀2次，得到较纯净的IBs8。 1.2.2生长曲线测定一级瓶培养过夜，按照2接种量转接二级瓶，隔0.5h取样。以空白LB培养基为参比，在600nm处测吸光度A，对时间作图，得生长曲线。 1.2.3IBs的

6、变性和复性称取一定量的IBs，按20mg/mL的比例加入8mol/L尿素，室温温和溶解2h，离心，取上清，缓慢滴入复性液(pH9.5甘氨酸氢氧化钠缓冲液)中，室温下，静止复性24h，调pH8.0，37胰蛋白酶酶解2h，测酶活性。 1.2.4酶活性测定方法9测定前新鲜配制0.001mol/L马尿酰L精氨酸的盐溶液。总测定体系3mL，测定波长254nm。加入酶溶液520L，立即调节灵敏旋钮至吸光度为零，间隔适当时间记录A值。调酶浓度到10min内水解反应不超过30。完全水解的A值为0.36。在测定范围内，数据显示底物的水解速率与酶浓度呈明显的正相关。一个酶活性单位定义为每1min水解1mol底物所

7、需要的酶量。由A254nm的变化计算酶活性。复性率以复性液中酶的总活性单位表示。同时测定蛋白质浓度，计算比活。 酶活性=SX(A254(A254nm/t)0.36SX)稀释倍数 1.2.5蛋白质含量测定采用Bradford法10，以牛血清蛋白(BSA)为标准蛋白质测定变性液上清中蛋白质含量。 1.2.6IBs对蛋白酶K的稳定性5经洗涤纯化后IBs悬浮于50mmol/LTrisHCl中，通过0.1mm针孔，使IBs匀浆化。然后稀释到pH8.0含50mmol/LTrisHCl和150mmol/氯化钠的缓冲液中，使A420nm=1。加入终浓度0.2mg/mL蛋白酶K，反应30min。通过测定A420

8、nm的变化确定IBs对蛋白酶K的酶解稳定性。 1.2.7IBs的化学稳定性5IBs经匀浆后，用50mmol/LTrisHCl缓冲液(pH8.0)稀释调到A420nm=记录加入的IBs量。将等量IBs稀释到不同浓度变性剂中，室温下放置溶解过夜，测A420nm，确定变性剂对IBs稳定性的影响。 2结果与讨论 2.1重组菌株生长曲线 重组菌株生长曲线见图1。 图1重组菌株E.ColiBL21(DE3)的生长曲线 结果表明，重组菌培养3h进入对数生长期，8h进入对数生长后期，12h进入稳定期。因此，最长培养时间为12h。 2.2不同诱导时机对菌体生长、IBs收率和复性率的影响 2.2.1早期诱导的影响

9、过夜培养的种子接二级摇瓶后分别培养2，3，4h后进行IPTG诱导，继续培养至12h收菌，称菌体湿重。超声波破碎菌体，收集IBs，8mol/L尿素溶液溶解IBs后稀释复性。复性24h后测酶活性，结果见表1。由表1可见，对数生长早期，如2，3，4h进行IPTG诱导后所得菌体量、IBs的量相当，但IBs复性率却有很大不同。对数生长期前诱导所得IBs的复性率比对数生长早期HJ4mm诱导低近50。 表1早期诱导对菌体生长及IBs复性的影响(200mLLB培养基) 注：各组培养时间均12h 2.2.2不同生长时期诱导的影响过夜培养的种子接二级瓶后分别培养3，8，12，22h进行IPTG诱导，诱导后继续培养

10、4h收菌，称菌体湿重，超声波破碎菌体，收集IBs，洗涤后称重即为IBs湿重，8mol/L尿素溶液溶解IBs后稀释复性，复性24h后测定酶活性，结果见HJ4mm表2。 表2不同生长时期诱导对菌体生长及IBs复性的影响(200mLLB培养基) 注：诱导后培养时间均4h 由表2可见，对数生长期诱导所得IBs的量高于对数生长早期和对数生长后期，此结论由SDSPAGE的电泳结果也得到证实，见图2。复性后的蛋白质可被胰蛋白酶充分酶解得相对分子质量35103的羧肽酶，见图3。生长后期IBs的复性率较高，可能是因对数生长期菌体生长旺盛，外源蛋白质表达速度快，蛋白质折叠错误率高，IBs不易复性，即IBs的质量低

11、；生长后期菌体生长减慢，外源蛋白质表达速度慢，折叠的正确率高，所得IBs易复性。 2.3不同诱导时机所得IBs对蛋白酶K的稳定性 蛋白酶K对未折叠好的蛋白区域具有强烈的水解功能，蛋白酶K酶解IBs后，混浊度下降，测A420nm，并对时间作图可得IBs蛋白质的酶解动力学曲线。见图4和图5。 由图4可见，诱导2，3，4h所得包涵体对蛋白酶K的酶解稳定性相差不大。由图5可见不同生长期诱导所得IBs对蛋白酶K的稳定性有明显的不同，蛋白酶K酶解12h(稳定期)和22h(衰亡期)诱导所得IBs的速度慢于1h和3h诱导所得的IBs；8h(对数生长后期)诱导产生的IBs处于两者之间。与表2的复性结果对照，可得

12、出如下结论：IBs复性率越高，对蛋白酶K的稳定性越高，越不易被蛋白酶K酶解。IBs中正确构象的比例含量越高，也预示着脂肪族，芳香族，疏水性氨基酸折叠进入蛋白质内部的几率越高，蛋白酶K的作用位点隐藏在蛋白质内部，也就越不易被蛋白酶K作用。 2.4不同诱导时机所得IBs对盐酸胍的稳定性 IBs在3mol/L盐酸胍中的溶解速率见图6、图7。 结果可见，对数生长期所得IBs以3h时诱导所得的IBs在3mol/L盐酸胍中的溶解速率稍差，2h和4h时诱导所得的IBs溶解速率相似；12h和22h诱导所得的IBs溶解速率较慢，1h，3h和8h溶解速率相似。表明复性率高的IBs的溶解速率低。根据已有的理论推测，

13、复性率高的IBs含有更高比例的正确折叠构象，诱导时机如何影响IBs复性率尚需进一步的理论研究。 参考文献 1TokatlidisK，DhurjatiP，MilletJ，etal.HighactivityofinclusionbodiesformedinEscherichiacolioverproducingClostridiumthermocellumendoglucanaseDJ.FEBSLett，1991，282(1):205208. 2GarciaFruitosE，GonzalezMontalbanN，MorellM.Aggregationasbacterialinclusionbodi

14、esdoesnotimplyinactivationofenzymesandfluorescentproteinsJ.MicroCellFact，2005，4:27. 3VenturaS，VillaverdeA.ProteinqualityinbacterialinclusionbodiesJ.TrendsBiotechnol，2006，24(4):179185. 4AmiD，NatalelloA，TaylorG，etal.StructuralanalysisofproteininclusionbodiesbyFouriertransforminfraredmicrospectroscopyJ

15、.BiochimBiophysActa，2006，1764(4):793799. 5DeGrootNS，VenturaS.EffectoftemperatureonproteinqualityinbacterialinclusionbodiesJ.FEBSLett，2006，580(27):64716476. 6ZhangXY，LiSX，YuanQS.TherenaturationofprocarboxypeptidaseBbyureagradientgelfiltrationandsomepropertiesofrecombinantcarboxypeptidaseBJ.ProteinPep

16、tLett，2005，12(7):671676. 7LiSX，ZhangYJ，TianLP，etal.Cloning，expressionofanewprocarboxypeptidaseBgeneinEscherichiacoliandpurificationofrecombinationcarboxypeptidaseBJ.ProteinPeptLett，2003，10(6):110. 8李素霞，张育坚，田丽萍，等.重组活性羧肽酶B在胰岛素原C肽制备工艺中的应用J.华东理工大学学报，2004，30(4)：387391. 9FolkJE，PiezKA，CarrollWR，etal.Carbox