胎盘儿茶酚—O—甲基转移酶单核苷酸多态性与子痫前期遗传易感性的关系研究

1、胎盘儿茶酚O甲基转移酶单核苷酸多态性与子痫前期遗传易感性的关系研究摘要 目的 探讨胎盘中儿茶酚-O-甲基转移酶（COMT）单核苷酸多态性与子痫前期遗传易感性的关系。 方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术，对138例子痫前期患者胎盘组织（子痫前期组）和126例正常晚期妊娠妇女胎盘组织（对照组）的COMT基因第4号外显子第158位密码子G与A的多态性进行分析，分析COMT单核苷酸多态性与子痫前期发生风险的关系。 结果 子痫前期组COMT基因型频率：野生型（GG）、杂合子（GA）、突变纯合子（AA）分别为58.7%、34.8%、6.5%，对照组分别为61.9%、33.

2、3%、4.8%，两组比较差异无统计学意义（P>0.05）。子痫前期组等位基因频率G、A分别为76.1%、23.9%，对照组分别为78.6%、21.4%，两组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 COMT基因第158/108位密码子的单核苷酸多态性与子痫前期的发病及病情轻重程度无相关性。突变基因型并没有增加子痫前期的发病风险。关键词 子痫前期；儿茶酚-O-甲基转移酶；单核苷酸多态；胎盘；遗传易感性中图分类号 R714.24+5 文献标识码 A 文章编号 1674-4721（2013）08（a）-0010-03子痫前期（pre-eclampsia，PE）是妊娠期严重并发症之一

3、，主要临床特征是妊娠20周后出现高血压蛋白尿，初产妇的PE发生率为3%7%，经产妇为0.8%5%，该病严重威胁母儿健康1。PE的主要发病机制是滋养细胞的浸润行为受到阻碍，使得子宫螺旋小动脉正常结构发生改变，结果导致胎盘着床位置变浅以及胎盘的缺血缺氧，最终出现严重的临床症状即PE的临床表型2-3。最近的报道发现，在胎盘的形成过程中，滋养细胞的浸润行为主要受到低氧环境（2.5%氧浓度）及儿茶酚胺-O-甲基转移酶（catechol-O-methyltransferase，COMT）代谢产物2-甲氧雌二醇（2-ME）的调控，在滋养细胞的浸润过程中，处于低氧状态的胎盘与一定浓度的2-ME是重要的协同刺激

4、分子，两者共同诱导滋养细胞的浸润，使之适应并促进孕期的血管重塑和组织间的氧化反应，形成成熟的母胎循环4。除此之外，动物学实验发现COMT基因敲除小鼠，在妊娠期会出现类似PE的临床症状5。研究还发现与正常妊娠胎盘组织相比，重度PE胎盘的COMT活性及2-ME水平均明显降低6。一直以来，在PE的病因及发病机制的研究中，焦点始终聚集于胎盘上，认为胎盘的作用比较关键，而治疗PE最直接最根本的方法是娩出胎儿，取走胎盘7-8。本研究拟从胎盘的角度，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术，对PE及正常妊娠孕妇的胎盘进行基因型分析，探讨COMT单核苷酸多态性与PE遗传易感性的关系。1

5、资料与方法1.1 研究对象收集2009年10月2012年7月在深圳市妇幼保健院妇产科住院的PE患者胎盘标本138例为PE组，孕妇平均年龄（31±4）岁，孕周（36.8±3.2）周；收集同期正常妊娠妇女胎盘标本126例为对照组，孕妇平均年龄（30±4）岁，孕周（39.3±0.8）周；两组年龄及孕周的差异无统计学意义（P>0.05）。PE诊断标准参照妇产科学第6版。1.2 方法1.2.1 标本采集和处理 在征得两组孕妇同意并签署知情同意书后，收取剖宫产术后及自然分娩后胎盘，大量无菌生理盐水将其冲洗干净，分离蜕膜及上皮组织，选取胎盘滋养细

6、胞层，切割成约为3 cm3 cm的组织块，装入无菌冻存管中，-80保存备用。采用QIAGEN公司Gentra Puregene 的组织DNA提取试剂盒，按照标准操作流程提取胎盘组织DNA。1.2.2 COMT基因型的检测 PCR：针对COMT基因第4外显子G1947G→A的突变位点应用引物设计软件Primer5自行设计引物。上游引物为F，其序列为5′-GGGCCTACTGTGGCTACTCA-3′；下游引物为R，其序列为5′-AGACCCTCACTGAGCTGCTG-3′，PCR总反应体系30 μl，反应条件为：98预变性5 mi

7、n，96变性30 s，62复性30 s，72 35 s，重复30个循环，72延伸5 min。限制性酶切反应：PCR扩增产物和Nia的酶切体系，总体积为20 μl，H2O 5.1 μl，10缓冲液（buffer）2.0 μl，乙酰基（BSA，10 mg/ml）0.2 μl，限制性内切酶Nia（104 U/ml）0.4 μl和PCR扩增产物12 μl。37 PCR仪中酶切5 h。酶切产物通过12%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，采用硝酸银染色，并用凝胶成像仪拍照记录。PCR产物酶切后COMT基因野生型的电泳图（G/G）为124、114、54、32 bp 4个片段，COMT

8、基因突变纯合子（A/A）为124、96、54、32、18 bp 5个片段，杂合子基因型（G/A）为124、114、96、54、32、18 bp 6个片段，其中片段32 bp因染色过浅凝胶电泳图中不可见，18 bp因片段过小而泳出，主要通过片段124、114、96 bp进行鉴别。如图1。1.3 统计学方法首先采用拟合优度χ2检验判断基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡，基因型频率及等位基因频率在两组间的分布比较采用t检验，所有的统计分析均在SPSS 13.0软件包中进行。2 结果2.1 PE组与对照组COMT基因型频率及等位基因频率分布的比较PE组野生型（GG）、杂合子（G

9、A）、突变纯合子（AA）的基因频率分别为58.7%、34.8%、6.5%，对照组分别为61.9%、33.3%、4.8%，两组比较差异无统计学意义（P>0.05）；PE组等位基因频率G、A分别为76.1%、23.9%，对照组分别为78.6%、21.4%，两组比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。PE组和对照组的COMT基因型分布采用拟合优度χ2检验，χ2值分别为0.02和0.01，P>0.05，符合Hardy-Weinberg平衡定律。2.2 COMT基因型频率在重度PE组、轻度PE组及对照组间的分布COMT各基因型频率在重度PE组、轻度PE组及对照组

10、间的比较，差异无统计学意义（χ2=0.58，P>0.05）（表2）。3 讨论3.1 COMT在PE发生中的主要作用PE是妊娠期严重并发症之一，到目前为止，仍然是孕产妇和围生儿死亡的重要原因。最新的科学报道显示，正常妊娠有赖于滋养细胞的浸润性行为。2-ME以及妊娠早期的低氧环境是诱导滋养细胞浸润子宫内膜的必要条件4，两者缺一不可。一旦条件发生改变，将导致胎盘的正常着床受到破坏，最终产生一系列严重的临床表型即PE症状。2-ME主要由胎盘COMT产生9。在正常情况下，胎盘中COMT的含量和活性是激素代谢的关键，当胎盘功能减退、酶活性降低时，将影响母胎循环中激素及其代谢产物的水平。研究表

11、明重度PE患者胎盘COMT的活性与正常妊娠胎盘相比明显减低10，推断胎盘中COMT的活性可能与PE的发生紧密相关。3.2 COMT单核苷酸多态性与PE发病的关系COMT是人体组织中广泛存在的甲基化酶，是雌激素代谢的关键酶。内源性雌激素E1与E2的代谢主要为羟化过程，产物为2-OH E1，2-OH E2，4-OH E1，4-OH E2和16α-OH E1。编码人COMT的基因位于22号染色体11，COMT基因的4号外显子有1个G1947→A的点突变，使编码的第158/108位氨基酸由缬氨酸（Val）变为甲硫氨酸（Met），导致COMT的热不稳定性改变。有报道显示，该酶的活性

12、在个体间差异很大12，在人群中，COMT的基因型可分为COMT-HH、COMT-HL和COMT-LL13。Bates等14发现，PE患者红细胞COMT活性显著高于正常妊娠者，但Barne的研究却显示PE患者胎盘的COMT活性显著降低10。由于缺乏从COMT的角度将胎盘功能与血管活性物质结合起来的研究，因此很难得出较为肯定的结论。研究发现PE有一定的遗传倾向，是一种多基因疾病。本研究主要探讨胎盘COMT单核苷酸多态性与PE发病的关系，检测了264例胎盘组织COMT的基因型，PE组138例，对照组126例。结果显示COMT基因频率在PE组及对照组的分布差异无统计学意义；基因型频率在两组间的分布差异

13、亦无统计学意义。结果显示胎盘组织的COMT基因G1947→A单核苷酸多态性与PE发病无相关性，COMT等位基因与PE无关联，突变基因没有增加PE的发病风险。本研究从胎盘的角度探讨了PE临床症状的发生机制，选取胎盘组织DNA样本进行检测，分析了影响COMT活性的突变位点G1947→A的基因型与等位基因是否与疾病相关。虽然本研究显示COMT的G1947→A突变与PE的发病无相关性，但仍然不能说明COMT单核苷酸多态性与PE的遗传易感性无绝对相关性，可能的原因包括：COMT基因可能有不止一个多态性位点，可能存在多个影响酶活性的突变位点；酶的活性受到上游序列的调控；或者由

14、于蛋白质的空间结构发生了改变等原因而降低了COMT的活性。本研究存在一定的局限性，例如只分析了COMT基因的一个多态性位点，其他基因和其他位点的多态性改变与PE发病的关系需要更深层次的探索。在接下来的实验中可继续探讨COMT在PE组和对照组是否存在RNA和蛋白质表达上的差异，并同时检测孕产妇血浆或血清中代谢产物2-ME含量，将有助于更全面地了解COMT与PE发病的关系，从而为PE的预测及个体化诊断治疗提供新的检测指标15。参考文献1 孙成娟，张为远.子痫前期易感基因的研究进展J.中华妇产科杂志，2008，43（12）：952-953.2 林其德.对子痫前期的新认识J.中华妇产科杂志，2009，

15、44（2）：81-83.3 Dekker GA，Sibai BM.Etiology and pathogenesis of preeclampsia：current conceptsJ.Am J Obstet Gynecol，1998，179（5）：1359-1375.4 Lee SB，Wong AP，Kanasaki K，et al.Preeclampsia：2-methoxyestradiol induces cytotrophoblast invasion and vascular development specifically under hypoxic conditionsJ.Am

16、 J Pathol，2010，176（2）：710-720.5 Kanasaki K，Palmsten K，Sugimoto H，et al.Deficiency in catechol-O-methyltransferase and 2-methoxyoestradiol is associated with pre-eclampsiaJ.Nature，2008，453（7198）：1117-1121.6 Dragun D，Haase-Fielitz A.Low catechol-O-methyltransferase and 2-methoxyestradiol in preeclamps

17、ia：more than a unifying hypothesisJ.Nephrol Dial Transplant，2009，24（1）：31-33.7 赵群，孔祥.子痫前期的病因学研究进展J.医学研究杂志，2012，41（3）：17-19.8 Shenoy V，Kanasaki K，Kalluri R.Pre-eclampsia：connecting angiogenic and metabolic pathwaysJ.Trends Endocrinol Metab，2010，21（9）：529-536.9 Casey ML，MacDonald C.Characterization of

18、 catechol-O-methyltransferase activity in human uterine decidua vera tissueJ.Am J Obstet Gynecol，1983，145（4）：453-457.10 Barnea ER，MacLusky NJ，DeCherney AH，et al.Catechol-o-methyl transferase activity in the human term placentaJ.Am J Perinatol，1988，5（2）：121-127.12 Spielman RS，Weinshilboum RM.Genetics of red cell COMT activity：analysis of thermal stability and family dataJ.Am J Med Genet，1981，10（3）：279-290.13 孙波，张为远，赵艳晖.儿茶酚氨-O-甲基转移酶单核苷酸多态性与妊娠高血压综合征关系的研究J.中华妇产科杂志，2004，39（1）：21-23.14 Bates GW，Whitworth NS，Jackson E Jr.Erythrocyte catechol-O-methylt