泰妙菌素完全抗原的研制与鉴别

1、泰妙菌素完全抗原的研制与鉴别动物源性食品中的抗生素残留问题已经引起世界各国的广泛关注,欧盟、美国等均对动物源性食品中的抗生素残留限量颁布标准。中国农业部在2002年的公告中规定92种兽药在动物源性食品中的残留限量。其中,泰妙菌素(Tiamulin,TML)在猪肉、鸡肉中的残留限量为100mg/g,猪肝中为500mg/g。泰妙菌素是一种截短侧耳素类动物专用抗生素,不仅对支原体有极强活性,对链球菌、金黄色葡萄球菌也有很强的抗菌活性,因此作为兽药和饲料添加剂被广泛应用。但TML在动物体内的残留可能对人类的健康造成严重的潜在威胁。目前,用于检测泰妙菌素残留的方法主要有气相色谱法、高效液相色谱法、气相色

2、谱质谱联用法,这些仪器分析方法灵敏准确,但样品处理过程繁琐,耗时较长,且仪器价格昂贵。免疫学检测方法具有灵敏度高、操作简单、省时等特点,很适合大量样品快速检测,而针对TML的免疫学检测方法尚未报道。TML属于小分子半抗原,相对分子质量仅为609.8,需要与大分子载体蛋白偶联后才能作为免疫原免疫动物。本研究根据TML的分子结构使用混合酸酐法和N,N-羰基二咪唑2种方法制备完全抗原并作鉴定、比较,对其完全抗原的制备作初步探讨。1、材料与方法1.1试验材料1.1.1试剂与溶液延胡索酸泰妙菌素,相对分子质量609.8,纯度≥98%,购于百灵威;牛血清白蛋白,Sigma产品;吡啶、戊二酸酐(Glu

3、taric an-hydride)、1,4-二氧六环、N-N-二甲基甲酰胺、氯甲酸异丁酯、三丁胺、N,N-羰基二咪(1,1′-Car-bonyldiimidazole,CDI),AR级。1.1.2主要仪器。TP-214分析天平,美国Den-ver公司;PowerPac3000电泳仪、GelDocXR凝胶成像系统,美国Bio-Rad公司;Nano Drop2000c分光光度计,美国Thermo公司;CMAGHS4加热磁力搅拌器,德国IKA公司。1.2方法1.2.1混合酸酐法制备TML-HS-BSA参照文献方法并作修改,取TML30mg溶于无水吡啶,加入戊二酸酐6mg,室温搅拌反应36

4、h,氮气吹干吡啶,残留物为泰妙菌素戊二酸酐半醛化合物TML-HS,用2mL体积比为11的N,N-二甲基甲酰胺和1,4-二氧六环混合溶液溶解残留物,加入三丁胺14μL,冰浴搅拌反应15min,加入氯甲酸异丁酯8μL,室温搅拌反应2h,产物为TML活化物,取BSA10mg溶于3mL0.1mol/L的Na2B4O7溶液(pH8.5),4预冷30min,将活化物逐滴加入BSA溶液,室温搅拌反应24h,4磷酸盐缓冲液(PBS)中透析3d,制得TML-HS-BSA,-20保存,备用。合成路线见图1。1.2.2N,N-羰基二咪唑法制备TML-C-BSA参照文献方法稍作修改,取15mgTML溶于5

5、00μL无水四氢呋喃,加入15mgCDI,37反应45min,真空抽干四氢呋喃,残留物溶于2mL,加入5mgBSA的PBS溶液,室温条件下缓慢反应3h,4PBS透析3d,即得TML-C-BSA,-20保存,备用。合成路线见图2。1.2.3完全抗原的表征与鉴定偶联物蛋白质量浓度的测定:使用Solarbio考马斯亮蓝法蛋白含量测试盒测定偶联物蛋白质量浓度。具体操作:分别配制空白管、标准管、测定管溶液混匀静置10min后于595nm比色,其中空白管含0.2mL双蒸水、0.8mL考马斯亮蓝试剂,标准管含0.2mL50mg/L的标准蛋白溶液、0.8mL考马斯亮蓝试剂,测定管含0.2mL待测蛋白溶液

6、、0.8mL考马斯亮蓝试剂,测定前用12个样做预试验,确保蛋白质量浓度在0100mg/L,否则应对蛋白做相应稀释。计算公式:C1=OD1×C2/OD2,其中,C1为待测液质量浓度,C2为标准液质量浓度,OD1为待测液吸光值,OD2为标准液吸光值。蛋白溶液的最终质量浓度由该公式得到的结果扩大相应稀释倍数。紫外扫描鉴定:用PBS配制相同质量浓度的TML、BSA标准溶液,同样用PBS调节TML-HS-BSA、TML-C-BSA溶液至相同质量浓度,在波长200320nm进行紫外扫描,分析扫描结果。SDS-PAGE凝胶电泳鉴定及偶联比估算:参照文献配制SDS-PAGE凝胶电泳所需各种溶液,浓

7、缩胶电压为90V,分离胶电压为120V,上样蛋白质量为3μg,上样溶液体积为20μL,考马斯亮蓝染色2h,脱色10h,脱色后用凝胶成像系统拍照分析,之后用软件BandScan分析凝胶电泳图,由载体蛋白和偶联物蛋白的位置估算出偶联比。2、结果与分析2.1偶联物蛋白质量浓度将测得的数值代入公式得到待测蛋白液质量浓度并作相应稀释倍数扩大,最终TML-HS-BSA的质量浓度为1.3g/L,TML-C-BSA的质量浓度为1.7g/L。2.2紫外扫描鉴定结果从紫外扫描图谱可见,TML在208nm有特征吸收峰(图3),BSA在280nm有特征吸收峰(图4),TML-HS-BSA和TML-C-BS

8、A的特征吸收峰分别位于273nm(图5)和275nm(图6),较BSA均有蓝移现象,初步说明偶联成功,比较二者波峰变化程度,前者较后者明显。2.3SDS-PAGE凝胶电泳鉴定结果偶联物蛋白的泳动速度小于BSA,说明其分子质量大于BSA,从而证明TML与BSA偶联成功。分析TML-HS-BSA和TML-C-BSA的条带(图7、图8)可以看出,前者较BSA条带滞后更明显,分子质量更大,说明有更多的半抗原已连接至载体。根据BSA和偶联物蛋白条带的位置估算出TML-HS-BSA和TML-C-BSA的偶联比分别约为123.6、18.1,混合酸酐法的偶联率要高于N,N-羰基二咪唑法。3讨论泰妙菌素是小分子

9、化合物,属于半抗原,需要与大分子蛋白载体偶联后才能作为免疫原免疫动物。通常改造后用于偶联蛋白的化学基团有-COOH、-NH2、-OH、-SH等,针对于这些基团的常用偶联方法包括混合酸酐法、碳二亚胺法、重氮化法、戊二醛法、N,N-羰基二咪唑法等。分析泰妙菌素化学结构可知,较适合改造的基团为-OH,该基团的偶联方法主要有碳二亚胺法、混合酸酐法、N,N-羰基二咪唑法。其中,碳二亚胺法和混合酸酐法首先要用戊二酸酐活化-OH,从而引入-COOH再进行偶联,而N,N羰基二咪唑法则是直接与-OH反应形成偶联,较上述2种方法操作简单。虽然碳二亚胺法合成效率较另外2种方法合成效率高,但在反应过程中容易发生蛋白自

10、连,混合酸酐法由于首先对引入的羧基进行活化,使其更易于和载体蛋白上的-NH2反应,有效的避免蛋白自连。CDI是咪唑的衍生物,其两端的咪唑结构能与氨、醇等官能团反应,形成稳定的含羰基结合物,从而将小分子半抗原连接至载体。其中,在与醇基的反应中首先生成酯基咪唑,然后再与蛋白上的氨基反应形成偶联。此外,3种方法所形成的连接臂长为碳二亚胺法通常认为连接臂的最适臂长为36个碳原子,太长或太短都不利于半抗原小分子抗原表位的充分暴露。本研究综合考虑各方面因素,使用混合酸酐法和N,N-羰基二咪唑法制备泰妙菌素完全抗原,紫外扫描结果显示,2种偶联物蛋白的特征峰都发生蓝移,说明偶联成功。SDS-PAGE结果显示,

11、偶联物蛋白的条带发生滞后现象,进一步证实2种方法均偶联成功。对完全抗原的鉴定,一方面是定性判断半抗原和载体蛋白是否偶联成功,另一方面是测定偶联比。偶联比的测定主要有紫外分光光度法、标记抗原示踪法、SDS-PAGE法、质谱法等。这些方法中较为常用的是紫外分光光度法和SDS-PAGE法。紫外分光光度法要求半抗原有紫外吸收且最大吸收峰应大于220nm,因为蛋白质在220nm以下会产生肽的强紫外吸收,如果半抗原的最大紫外吸收峰小于220nm,会与肽的紫外吸收发生重叠,大于220nm时,则可根据载体蛋白及半抗原特定吸收峰的光密度值和各自的摩尔消光系数计算出偶联比。SDS-PAGE法是根据载体蛋白在偶联后分子质量增大,通过比较载体蛋白和偶联物蛋白的条带位置进一步推算出偶联比。上述2种方法均操作简便,结果可靠,但由于TML的最大紫外吸收峰位于208nm,小于220nm,紫外分光光度法不适用,故本研究采用SDS-PAGE法测定分子偶联