免疫学检测原理及临床应用

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2、测 免疫分子检测 免疫学诊断与检测,掌握：原理 临床应用,概念,免疫学 细胞生物学 分子生物学 应用：免疫相关疾病的诊断、病情检测和疗效评价等,抗原 抗体 免疫细胞 细胞因子,检测,理论和方法,定性 定量,第1节 基于抗原-抗体反应 （antigen antibody reaction）的检测方法,一、原理 二、反应的特点 三、影响因素 四、基本检测方法,一、原理,1、抗原抗体反应的 特异性 2、抗原抗体反应的 可见性 抗原抗体按适当比例结合，形成肉眼可见的现象,应 用,1、利用已知抗原检测未知抗体,1）检测病原微生物的相应抗体以辅助诊断疾病： 伤寒病、流行性乙型脑炎、AIDS病等。 （2）检

3、测自身抗体诊断自身免疫病：SLE、类风湿性关节炎等,2、利用已知抗体检测未知抗原,1）鉴定病原菌：诊断疾病 （2）检测肿瘤相关抗原：检测甲胎蛋白以诊断肝癌 （3）检测血型抗原、HLA抗原：鉴定血型，亲子鉴定 （4）检测药物半抗原： 确认运动员是否服用兴奋剂,一）抗原-抗体结合反应的特点,特异性 带现象与可见性 可逆性,取决于抗原表位与抗体高变区结合部位空间构型的互补的程度,亲和力（affimity） 亲合力（avidity,抗原抗体结合的带现象与可见性,一）抗原-抗体结合反应的特点,可逆性,一）抗原-抗体结合反应的特点,低pH值 高浓度盐 冻融等,AgAb解离,取决于亲和力大小,二）抗原抗体反

4、应的影响因素,电解质 酸碱度 温度 抗原抗体的性质,1.电解质： 亲水性-疏水性 失去电荷-发生凝集,二）抗原抗体反应的影响因素,2、酸碱度： 最适pH值：68 假阳性 假阴性,二）抗原抗体反应的影响因素,3.温度： 适当温度-增加碰撞机会 加快结合速度 37,二）抗原抗体反应的影响因素,4、抗原和抗体的性质 关键因素-特异性和亲和力 决定因素-二者的比例,二）抗原抗体反应的影响因素,三） 抗原或抗体的检测方法,凝集反应 沉淀反应 补体参与的反应 免疫标记技术,一）凝集反应（agglutination,颗粒性抗原（红细胞、细菌、 乳胶颗粒等）与抗体特异性结合，形成肉眼可见的凝集块,1、直接凝集

5、(direct agglutination) 2、间接凝集 （indirect agglutination） 3、间接凝集抑制试验 （in direct agglutination inhibition test） 4、协同凝集试验 （co-agglutination test,一）凝集反应（agglutination,二）沉淀反应（precipitation,可溶性抗原（免疫球蛋白、细胞裂解物、组织浸液等）与相应抗体结合， 形成不溶性免疫复合物，出现不透明的沉淀物。多在半固体琼脂凝胶上进行，形成白色的沉淀,1、单向免疫扩散（single immunodiffusion,常用于测定IgG、Ig

6、M、IgA、C3、C4等,沉淀环,抗体混于琼脂凝胶中制板,环的直径与抗原含量成正相关,2、双向免疫扩散（doule immunodiffusion）：常用于抗原或抗体的定性检测、组成和两种抗原相关性分析,3、免疫电泳（immunoelectrophoresis,对流免疫电泳(counterimmunoelectrophoresis,4、免疫比浊法（immunonephelomtry）：快速简便。用于血清IgG、IgA、IgM、 补体C3、C4含量测定,三）补体参与的抗原抗体反应,1、50 %补体溶血试验（CH50测定） 血清总补体量测定,2、补体结合试验(complement fixation

7、 test)：检测抗原或抗体。 原理：用已知的指示系统检测试验系统是否结合补体进行诊断,试验原理,检测系统：待测样品和已知抗原（或抗体,指示系统：SRBC和溶血素,溶血阴性；不溶血阳性,用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断的敏感性,荧光素 ：异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光）、藻红蛋白、 罗丹明（红色荧光,放射性同位素： 125I、131I,酶：辣根过氧化物酶、硷性磷酸酶,免疫荧光检测法（IFA,放射免疫检测法（RIA,酶免疫检测法（EIA,四）免疫标记技术,液相（ELISA）、固相（免疫组化技术,1、免疫荧光法（immunofluorescence,IF,用荧光标记抗体，再与待

8、检标本中抗原反应那个，所形成的抗原抗体复合物在荧光显微镜下散发荧光，借此对抗原进行定性和定量,间接ELISA,双抗夹心法,2、酶联免疫吸附试验 （enzyme linked immunosorbent assay, ELISA法,抗细胞因子的抗体包被,1,2,3,4,抗原包被,用于效应细胞分泌的单一细胞因子的测定，也可测定分泌特异抗体的B细胞的频数,BAS-ELISA法（ biotin-avidin-system，生物素-抗生物素系统-ELISA法）：敏感性更高。用于抗原抗体以及DNA、RNA的检测,卵白及某些微生物中的蛋白质,3、免疫组化 (immunohitochemistry,应用标记的

9、抗体与组织或细胞抗原反应，借助形态学观察，对组织或细胞表面抗原进行定性、定量、定位检测,4、放射免疫测定法 （radioimmunassay,RIA,用发射性核素标记抗体或抗原进行免疫学检测,5、化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay,将发光物质标记抗原或抗体，发光物质在反应剂激发下生成激发态中间体，当回复至稳定的基态时发射光子，通过自动发光分析仪测定管子参量，可反应样品中抗体或抗原含量,6、免疫印记法（immunoblotting,又称western 印记法：结合凝胶电泳和固相免疫技术，将借助电泳所区分的蛋白质转移至固相载体，在应用酶免疫、放射免疫等技术

10、进行检测,第2节 免疫细胞检测,机体免疫功能状态的重要指标 免疫细胞来源-外周血,一）免疫细胞及其亚类计数,1、淋巴细胞的分离：外周血葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法,白膜层,单核细胞,淋巴细胞,B,T,吸附分离,过尼龙毛柱分离,1）尼龙棉柱分离法 B细胞滞留与柱上 T细胞流出 （2）E花环分离法 成熟人T细胞表面有CD2，绵羊红细胞的受体,2、淋巴细胞亚群的分离,3）洗淘法（panning）（4）流式细胞仪（flowcytometry,FCM,5）磁珠分离法： 用抗CD4交联的微珠可将T细胞 中的CD4+T细胞与CD8+T细胞分,3、淋巴细胞亚群计数,免疫荧光计数 微量细胞毒试验,二）淋巴细胞

11、功能测定,1、测定淋巴细胞功能的体外试验,1）T细胞增殖试验（淋转）： 丝裂原、抗CD3单克隆抗体等能非特异地激活T细胞，使之发生转化增殖，计算淋巴母细胞转化率（正常值6580,1、细胞增殖试验具体方法,形态学观察法 3H-TdR渗入法：用液体闪烁仪测定样品的射线放射活性 MTT法,检测CTL、NK、 LAK、TIL细胞杀伤靶细胞的功能 51Cr释放法 乳酸脱氢酶释放法 细胞凋亡检查法：TUNEL法（TdT dependent dUTP-biotin nick end labeling）、FACS测定法,2）淋巴细胞介导的细胞毒试验（LMC,3）分泌功能测定,检测细胞因子分泌细胞 检测抗体形成

12、细胞,2、测定淋巴细胞功能的体内试验,结合菌素试验迟发型超敏反应,迟发型超敏反应：旧结核菌素试验（ OT试验 ） 皮试（+）有一定的细胞免疫能力 皮试（）细胞免疫功能缺损,第3节 免疫分子检测,一）免疫球蛋白测定 1、体外用已知抗原检测相应抗体 2、用已知抗体定性、定量测定各类免疫球蛋白,二）补体测定,免疫比浊法 ELISA RIA,三）细胞因子检测,1.免疫学测定法 鉴定分离的淋巴细胞亚群，监测某些疾病状态的细胞免疫功能。IL-2、IL-2R、rIFN 、TNF等检测 ELISA法 生物活性测定法 聚合酶链反应（PCR）法,三）细胞因子检测,2.生物活性测定法 原理：不同细胞因子具有特定的生

13、物学活性，借助相应指示系统与之反应，从结果得知细胞因子的活性,2.生物活性测定法,促进细胞增殖和增殖抑制法 抗病毒活性测定法 直接杀伤法 趋化活性测定法,3.分子生物学测定法 PCR,四）CD分子、表面受体和粘附分子的测定,五）HLA分型,第23章 免疫学防治,免疫学预防 免疫学治疗,一）人工主动免疫 （artificial active immunization） 用疫苗、类毒素接种机体，使之产生特异性的免疫，从而预防感染的措施,一、人工免疫,免疫预防,人工主动免疫常用制剂疫苗、类毒素 死疫苗（灭活疫苗）是选用免疫原性强的病原体，经理化方法使其失去活力制备而成的疫苗。伤寒菌、百日咳杆菌、霍乱

14、弧菌、钩端螺旋体、流感病毒、狂犬病病毒、乙脑病毒疫苗均为灭活疫苗。 减毒活疫苗：是用减毒或无毒力的活病原体制成的疫苗。脊髓灰质病毒、卡介苗、麻疹病毒疫苗是常用的减毒活疫苗。 类 毒 素：细菌外毒素经甲醛处理后，失去毒性而保留其免疫原性即为类毒素。常用的类毒素有破伤风类毒素、白喉类毒素等,死疫苗和活疫苗的比较,二）新型疫苗,亚单位疫苗 乙肝表面抗原制备乙肝疫苗 结合疫苗 合成肽疫苗 基因工程疫苗,三）核酸疫苗,人工被动免疫 是给人体注射含特异性抗体的免疫血清或细胞因子等制剂，以治疗或紧急预防感染疾病。人工被动免疫力维持的时间短，约23周。常用制剂有： 抗毒素 人免疫球蛋白制剂 细胞因子制剂 单抗/基因工程抗体,免 疫 治 疗(immunotherapy,借助物理、化学和生物