研究Smad3基因在猪卵母细胞成熟过程中的表达特征

1、研究Smad3基因在猪卵母细胞成熟过程中的表达特征动物卵母细胞体外成熟 （IVM）、体外受精（IVF）、卵胞浆内单精子注射（ICSI）和克隆等技术是动物胚胎工程的主要研究内容之一。近年来，家畜卵母细胞的体外成熟培养技术得到进一步提高，不仅为家畜胚胎生物技术提供了大量卵源，同时也是研究卵母细胞发生和发育规律的有效手段,但仍存在卵母细胞的成熟率、卵裂率及其囊胚发育率低等问题。为解决这一难题，秦鹏春等进行了大量的研究工作，认为FSH和LH这两种激素对猪卵母细胞IVM和排卵起到至关重要的作用.SMAD3是TGF-β （transforming growth factor β）的下游

2、受体激活蛋白。TGF-β超基因家族是在卵泡的生长、发育、闭锁及卵细胞的成熟和甾体激素的产生等方面都有重要的作用.SMAD3是其下游信号传导分子,TGF-β首先与TGF-βI（ITGF-βreceptor typeII）结合，迅速磷酸化TGF-βI（TGF-βreceptor typeI），继而激活SMAD3使其磷酸化，并与SMAD4结合转移入核，调节靶基因的功能.有大量实验表明，TGF-β/Smads通路对卵泡的发育、颗粒细胞的增值有重要作用，其变化可影响内分泌激素的作用，从而影响卵巢的功能.开发优良家畜的生殖潜能，直接为社

3、会提供优质的生殖配子或胚胎，必将创造更大的经济和社会价值。因此，本实以猪卵做研究对象，研究Smad3基因在猪卵母细胞成熟过程中的表达特征，为阐明Smad3基因与卵母细胞体外成熟的关系奠定基础。1 材料与方法1.1 材料猪卵巢来自青岛市即墨屠宰场屠杀的青年母猪。采集卵巢后将其放入盛有青霉素、链霉素的37生理盐水保温瓶中，2 h内送回实验室进行卵母细胞的收集。将分别培养到0、24、36 h和48 h的COCs进行透明质酸酶消化，去除卵母细胞周围的颗粒细胞，Hoechst染色后在倒置显微镜下观察各个不同时期的细胞形态。卵母细胞GV期时卵内有一个较大的核，位于近边缘处，核膜清晰。GVBD期卵母细胞生发

4、泡破裂，核膜消失，染色质凝集成团块状。M期卵母细胞染色体形成，并有规律的排列在赤道板上。M期卵母细胞最显着的特征是排出第一极体。卵母细胞周围的卵丘细胞在结构上与卵母细胞相联系，参与GSH的合成。已有研究证明，卵丘细胞对于牛、猪和仓鼠卵母细胞中GSH合成起重要作用。GSH在M期卵母细胞中的浓度大约是GV期卵母细胞中的2倍。在受精卵和胚胎早期发育阶段，GSH浓度迅速下降.GSH有还原型和氧化型（GSSG）2种形式。用分光光度计读取不同浓度谷胱甘肽的分光光度值，做成如图1的标准曲线。1.2 方法1.2.1 卵丘细胞-卵母细胞复合体的采集 对采集的卵巢用37的生理盐水清洗34次，用18号针头的20 m

5、L的注射器，从直径36 mm卵泡的中抽吸卵丘细胞-卵母细胞复合体（COC）。为了保护卵母细胞，抽吸前在注射器中吸取少量预热的TCM199培养液。抽完后将盛有COCs的50 mL离心管放置于38.5的水浴锅中静置以使COCs沉淀，每次静置1520 min,弃上清液，用TCM199进行清洗23次，慢慢进行吹打，防止卵母细胞周围卵丘细胞脱落。将处理好的含有COCs的TCM199转入培养皿中，将培养皿置于体视显微镜下，捡出有3层以上卵丘细胞的COCs.1.2.2 卵丘细胞-卵母细胞复合体的体外培养 把清洗干净的COCs用吸管转移至提前做好的培养滴中（6 cm培养皿，每个液滴150 μL,38，5

6、% CO2,饱和湿度的培养箱）进行培养，其上覆盖矿物油。成熟培养液：TCM199培养液中添加L-半胱氨酸0.57 mmol/L、FSH 0.5 μg/mL、LH 0.5 μg/mL和 EGF 10 ng/mL.培养0、24、36h和48h后，进行Hoechst染核（15min），在倒置显微镜下观察GV、GVBD、M和M4个不同时期卵母细胞细胞核的形态，统计各个时期的比率，并进行分类收集。1.2.3 卵母细胞核质成熟的评定 细胞质成熟主要检测指标的是谷胱甘肽在4个不同时期（GV,GVBD、M和M）表达量的变化。用GSH检测试剂盒对GSH进行检测，按照Gasparrini等的方法，用紫

7、外分光光度计测定猪卵母细胞内的GSH浓度。细胞核成熟检测指标主要是统计卵母细胞在培养48 h后排出第一极体的比率。1.2.4 卵母细胞不同成熟时期 Smad3 基因 mRNA 的表达检测 将抽取的COCs,分别培养到0、24、36、48 h后消化分离卵母细胞和卵丘细胞，分别鉴定收集GV、GVBD、M和M的卵母细胞，利用单细胞RT-PCR技术检测Smad3基因的相应时期的表达情况。RT反应体系：5× RT Buffer,4 μL;Enzyme Mix,1 μL;047A primerMix,1 μL;RNase Free 双蒸水，4 μL. RT 反应条件：2

8、5，10 min;37，15 min;85，5 s;4，∞。实验采用β-actin 作为内参基因。扩增Smad3基因的引物序列如表 1. 反 应 体 系 为 cDNA,2 μL;SYBR Premix ExTaqTM（2×），12.5 μL;RNase-free water,9.5 μL;Forwardprimer,1 μL （5 μmol/L）；Reverse primer,1 μL （5 μmol/L）；共计20 μL.反应条件：95 10 min;95 15 s,601 min,72 10 s,循环40次。

9、所用的数据均进行了中值标准化，平均数和标准差来源于3 个重复测量的结果，并且样品基因的相对表达量均进行了绘图。每个试验均重复3 次。计算公式为2-（Cp目的基因-Cp内参基因）。1.2.5 卵母细胞不同成熟时期 SMAD3 蛋白磷酸化水平检测 利用Western blot检测体外减数分裂成熟不同时期磷酸化Smad3的表达量，将COCs在体外培养0、24、36、48 h后，收集卵母细胞并Hoechst染核后，分别鉴定收集GV、GVBD、M和M的卵母细胞，用PIPA 裂解液和 SDS -PAGE 蛋白上样缓冲液处理，在冰上处理30 min,处理过程中每隔10 min,悬浮震荡12 min,裂解后，

10、再加入4 μL SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液，沸水处理5 min,未进行实验的样品可以置-20 保存。实验中用到的一抗为Rabbit mab（按1200稀释），二抗为辣根过氧化物标记的山羊抗兔IgG（按11000稀释）。1.3 统计分析卵母细胞GV、GVBD、M和M各时期的比例用ANOVA 方法分析。来自AVOVA 的重要结果再用Tukey 分析。Western Blot 结果图片扫描后，利用IPWIN 60进行灰度分析。40× 镜下进行各级卵母细胞计数，并将其比例利用SAS 软件进行方差分析。将Smad3基因的定量PCR 结果和GSH表达量测定结果利用SAS 软件进行方

11、差分析.对所有的分析结果P2 结 果2.1 卵母细胞到达不同时期的比率 统计卵母细胞到达GV、GVBD、M和M4个不同时期的比率。如表2所示。2.2 卵母细胞细胞质成熟-GSH的测定 根据图1标准曲线，计算出GV、GVBD、M和M4个不同时期GSH的浓度。在本实验中，培养的卵母细胞的谷胱甘肽水平随着培养时间的延长有所增高。说明在培养过程中卵母细胞细胞质成熟水平提高了。但是还不能达到体内GSH的水平，说明体外培养的环境还需要进一步提高。如图2、3所示，GVBD、M期与GV期相比差异显着（P有关采集卵巢所用生理盐水温度的研究很多，从20、25、30、31一直到37、39均有研究.刑风英等报道，在2

12、2、30、37、38.5、40下保存卵巢，随着保存温度不断升高，卵母细胞的体外成熟、卵裂率和囊胚率明显下降，37的生理盐水保存猪卵巢的效果最好。Prather等也曾报道了25和39的生理盐水温度对卵母细胞发育潜力有影响。在取卵时，应先在水浴锅内预热生理盐水达到所需温度，本试验在37生理盐水中保存猪卵巢，2 h内将卵巢运回实验室。但是由于屠宰场到达实验室的路程较远，再加上气温等外界诸多条件的影响，卵巢在到达实验室时，温度大约降低45，因此，取卵时生理盐水的温度要根据天气变化做适当的调整，预防温度过低，影响卵母细胞体外成熟效果。激素对猪卵母细胞的体外成熟起着关键的作用。在体内环境中，卵母细胞在内源

13、激素的作用下逐渐生长、发育、成熟，最后在LH峰的作用下排出体外，FSH与卵丘的扩张和卵母细胞质成熟有关。激素在猪卵母细胞体外成熟的影响中，发现猪在无激素的存在时也趋于发生减数分裂恢复，但培养液中加入FSH和LH,会明显加速减数分裂，而且LH可促进细胞质成熟.卵母细胞和颗粒细胞共培养的条件下，细胞有很好的生长发育情况，在裸卵的情况下，卵母细胞的生长出现停滞不前的状态。结果说明，颗粒细胞对卵母细胞的发育有至关重要的作用。它可以提供卵母细胞的发育所需要的各种营养物质，所以颗粒细胞在卵泡发育的早期起着支持细胞的作用。在体外成熟过程中，卵丘细胞和卵母细胞存在着一定的相互作用，两者之间有间隙连接，可以相互

14、传递营养物质和信息，从而进一步促进卵母细胞的成熟。所以说，抽取完整的健康的卵丘细胞对卵母细胞体外成熟有至关重要的作用。有研究发现，在猪的卵母细胞体外成熟过程中，在不存在卵丘细胞的情况下，向培养液中添加一定量的谷氨酰胺，即使能够促进GSH的含量，但是能够阻滞胚胎发育。因此有学者认为，卵丘细胞的扩散可以作为卵母细胞体外成熟的判断标准之一。3.2 卵母细胞成熟中 GSH 和半胱氨酸的作用卵子的成熟包括核的成熟和细胞质的成熟。如果细胞质成熟不充分，那么卵胞质中就会缺少使鱼精蛋白二硫键分解和染色质解聚的因子，包括谷胱甘肽（GSH）、核质因子（nucleoplasmin）和细胞成熟促进因子（MPF）等，精

15、子进入后，精核解聚受阻造成受精失败。因为核成熟进程影响细胞质成熟，而细胞质成熟对细胞核成熟又具有促进作用。体外核成熟的完成并不能保证细胞质的正常成熟，细胞核和细胞质的成熟具有协调性。所以检测卵母细胞中GSH的含量代表了细胞质的成熟状态。GSH在哺乳动物细胞中发挥着重要的生物学作用，参与卵母细胞的成熟.半胱氨酸是GSH的前体物质，在牛卵母细胞IVM时，疏基复合物能增加细胞内的GSH的浓度，并保持GSH高浓度状态，从而提高胚胎的发育率.在猪卵母细胞成熟过程中，培养24 h和36 h时，卵母细胞内GSH的浓度差异是不显着，而在48 h时，相对于GV期，GSH的浓度显着增高，当卵母细胞进入M期时，GS

16、H浓度达到最高峰。有研究证实，高浓度的半胱氨酸在成熟培养全过程中能显着影响囊胚的发育，用含半胱氨酸的培养液培养猪的卵母细胞，可提高猪卵母细胞的成熟率.细胞内GSH的浓度较低可能是卵母细胞发育能力较低的原因。确切地说，GSH是卵母细胞活性和发育能力的生化标志物。3.3 SMAD3 对卵母细胞发育的影响SMAD3 在发情前期、发情期、发情后期以及乏情期的大鼠卵巢均有表达，定位于原始和初级卵泡的卵母细胞，腔前卵泡和小有腔卵泡期定位于颗粒细胞，大有腔卵泡中表达变少。Smad3在TGF-β抑制T细胞的活化及增殖功能方面发挥重要作用.Wolfraim等研究急性T细胞性白血病患儿体内Smad3基因

17、的表达情况，结果发现虽然Smad3 mRNA表达水平正常，但是患儿体内检测不到SMAD3蛋白质，研究证实，TGF-β对白血病患者淋巴细胞增殖的抑制作用是Smad3途径依赖的。Smad3属于受体激活的Smads,它主要转导TGF-β和活动素的信号。Smad3基因剔除研究部分阐明了Smad3基因在脊椎动物发育中的功能。有实验表明，在Smad3基因缺失的小鼠体内卵泡发育紊乱，窦前卵泡向窦卵泡的发育受阻，凋亡基因的表达改变，颗粒细胞凋亡增加，闭锁卵泡显着增加.还有研究显示，Smad3基因缺失的雌性小鼠缺乏正常的动情周期，不能正常排卵；体外培养Smad3基因缺失的小鼠窦前期卵泡对FS

18、H的刺激反应极为有限，卵泡中颗粒细胞数量很少，卵巢和颗粒细胞中CyclinD2等基因的表达明显减少，FSH不能刺激其卵泡的早期发育。另有研究发现，表皮生长因子促进卵巢颗粒细胞的增值需要SMAD3的存在.研究结果表明，Smad3 基因mRNA 水平随着卵母细胞的发育表达量逐渐升高，在到达M期时，Smad3基因mRNA水平最高，与GV期mRNA水平相比差异极显着（PSMAD3在卵母细胞减数分裂成熟中的表达以及磷酸化变化是逐渐上升的，该基因在IVM过程中，促进细胞的减数分裂。为最终完善卵母细胞成熟的分子调控机制，实现对卵泡卵母细胞发育的精确调控，开发优良家畜的生殖潜能，促进优良家畜品种的培育奠定了基础。参考文献：1 周洪彬， 肖雄， 包磊， 等。 猪体外胚胎生产的研究进展J. 中国农业科学， 2005, 39（7）： 1457-1463.2 秦鹏春， 谭景和， 吴光明， 等。 猪卵母细胞体外成熟和受精的研究J. 中国农业科学， 1995, 28（3）： 58-66.3 Evin J A, Yan C, Matzuk M M. Oocyte-expressed TGF-βsuperfamily members in female fertility J. Mol Cell Endocrinol,2000,