PCR及其衍生技术

1、第十一章,聚合酶链反应,PCR,及其衍生技术,PCR,的用途,体外扩增特异,DNA,片段,的技术，能,快速,特,异,地扩增目的,DNA,片段,能通过试管内的数小时反应将特定的,DNA,片段扩增数百万倍,迅速获取大量的单一核酸片段，为分子生,物学研究提供了强大的工具,发展历程,1953,年,Watson,和,Crick,提出,DNA,双螺旋,结构及,半保留复制,模型,1958,年,Meselson,和,Stahl,用实验证实,DNA,半保留复制模型,70,年代以来，人们采用两种思路去尝试建,立基因的无性繁殖体系，一是,基因克隆,技,术，二是,体外扩增,技术,1971,年,Khorana,美国,M

2、IT,教授,1968,年,诺贝尔医学奖得主）：“经过,DNA,变性，与,合适引物杂交，用,DNA,聚合酶延伸引物，并,不断重复该过程便可克隆,tRNA,基因。,核酸体外扩增最早设想被遗忘原因,1,很难进行测序和合成寡核苷酸引物,2,1970,年,Smith,等发现了,II,型限制性内切,酶，体外克隆基因已成为可能,1976,年,台,湾,省,籍,科,学,家,钱,嘉,韵,Alice,Chien,从黄石国家公园的嗜热菌,Thermus,aquaticus,中分离出热稳定的,Taq,DNA,聚合酶,1985,年，美国,Cetus,公司人类遗传研究室的,Mullis,发明聚合酶链反应,Polymeras

3、e,Chain,Reaction,PCR,Saiki,等首次应用,PCR,法,成功地扩增了人,珠蛋白的,DNA,并应用于,镰刀状红细胞贫血的产前诊断,1988,年,Saiki,开始将,耐热性,Taq,DNA,聚合酶,应用于,PCR,整个反应只加一次酶即可，扩,增特异性和效率都明显改善，操作大为简化,1989,年被誉为“分子年”，列,PCR,为十余项,发明之首,1993,年,Mullis,荣获诺贝尔化学奖,PCR,的基本原理,试管中进行的,DNA,复制反应，依据,DNA,半保留复制,的机理,体外,DNA,分子于不同温度下可,变性和复性,的性质,通过人为控制体外合成系统的温度，使,双链,DNA,变

4、成单链,单链,DNA,与人工合成的,引物退火,DNA,聚合酶使,引物沿着单链模板延伸为双,链,DNA,待扩增片段,高温变性,低温退火,中温延伸,PCR,每一步的转换通过,温度的改变,控制,DNA,模板解链,变性,引物与模板结合,退火,DNA,聚合酶催化新生,DNA,的合,成,延伸,三个步骤构成,PCR,反应的一个,循环,此循环反复进行，可使目的,DNA,得以迅速,扩增,n,理论扩增率,2,递增,n,为循环次数,25,30,循环，目标,DNA,可增加,10,9,倍,实际扩增率,n,X,为,PCR,的实际扩,增率,平均约为,75,由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因,素，扩增产物的增加，逐渐由指

5、数形式变为,线性形式，所以实际上进行,30,个循环后，扩,增倍数一般可达,10,6,10,7,以上“变性、退火、延伸”三部曲为,PCR,一,轮循环,PCR,扩增曲线,PCR,反应体系与流程,反应体系,模板,DNA,或,RNA,引物,Taq DNA,聚合酶,10,PCR,缓冲液,1.5,4,mM,Mg,2,0.2,mM,dNTP,反应流程,预变性,变性,退火,25,延伸,循环,35,延伸完全,终止,一,PCR,的反应体系,1,引物,primer,2,酶,Taq DNA polymerase,3,dNTP,4,模板,template,5,2,Mg,magnesium,1,引物,引物：决定,PCR,

6、反应的特异性,PCR,产物的特异性取决于引物与模板,DNA,互补的程度,理论上，只要知道任何一段模板,DNA,序,列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引,物，用,PCR,就可将模板,DNA,在体外大量,扩增,引物设计的原则,基本原则是最大限度地提高扩增效率和特,异性，同时尽可能抑制非特异性扩增,引物长度,15-30bp,常用,20bp,左右,引物的有效长度不能大于,38 bp,否则最适,延伸温度会超过,TaqDNA,聚合酶的最适温度,74,，不能保证,PCR,扩增产物的特异性,引物扩增跨度,以,500bp,为宜,特定条件下可扩增长至,10kb,的片段,引物碱基,G+C,含量以,40-60,为宜,

7、G+C,太少扩增效果不佳,G+C,过多易出现非,特异条带,ATGC,最好随机分布，避免,5,个以上的嘌呤或,嘧啶核苷酸的成串排列，尤其,3,端不应超过,3,个连续,的,G,或,C,因为这样会使引物在,G+C,富集区,引发错,误延伸,避免引物内部出现二级结构和引物间互补,产生非特异性的扩增条带,特别避免,3,端的互补，否则会形成引物二聚体,引物,3,端的碱基要求严格配对（不能做任何,修饰,特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端,碱基不配对而导致,PCR,失败,引物,5,端可修饰,引物,5,端限定着,PCR,产物的长度，但对扩增特,异性影响不大；引物,5,端碱基可不与模板,DNA,互补而呈游离状

8、态；引物,5,端最多可加,10,个碱,基而对,PCR,反应无影响,3,5,5,3,启动子序列,定点突变,探针标记,限制性内切酶的识别序列,引物的特异性,引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同,源性,引物量,每条引物的浓度,0.1 0.5,M,以最低引物量产,生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且,可增加引物之间形成二聚体的机会,实例：设计人类,GAPDH,基因,mRNA,的引物,1,用,Primer Premier,软件设计引物,2,在,UCSC Genome Browser,上验证（如果,失败则重新设计,1,我们设计的引物，是根据,GAPDH,的,mRNA,序列设计的

9、，理论扩增长度是,318bp,但它,却在人类基因组上扩增出了,两个片段,2,第一个片段来自,12,号染色体,的扩增，长度为,2409bp,第二个片段来自,X,染色体,的扩增,片段长度是,318bp,3,那么，那个扩增片段才是正确的呢？我们设,计的这一对引物可否用于扩增人类,GAPDH,基因片段呢,12,号染色体扩增出的序列是真正的,GAPDH,基因,在下面的序列比对中，我们可以发现,X,染,色体上被扩增出的序列实际上是,GAPDH,的,加工的假基因,processed pseudogene,因此，如果我们能保证作为模板的,cDNA,不,混杂有染色体,DNA,就可以用这一对引物,扩增,GAPDH

10、,2,酶及其浓度,目前有两种,Taq DNA,聚合酶供应,天然酶：从水生嗜热杆菌中提纯,基因工程酶：大肠菌合成,一个典型的,PCR,反应约需酶量,1,2.5U/100 ul,体系,浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产,物量减少,Taq,酶的保真性不高,53,聚合酶活性和,53,外切酶活性,无,35,外切活性,在,PCR,反应中如发生某些碱基的错配，该,酶是没有校正功能的。保真性不如,Pfu,DNA,聚合酶,等,3,dNTP,的质量与浓度,在,PCR,反应中,dNTP,应为,50,200,M,浓度,过低会降低,PCR,产物的产量,注意,4,种,dNTP,的浓度要相等（等摩尔配制,如其中任

11、何一种浓度不同于其它几种时（偏,高或偏低），就会引起错配,高浓度的,dNTP,可与,Mg,2,结合，使游离的,Mg,2,浓度下降，影响,DNA,聚合酶的活性,4,模板,DNA,模板,DNA,的来源,微生物中提取,DNA,从细胞中提取,DNA,血细胞、绒毛、尿样、毛,发、精斑、口腔上皮细胞,固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶,K,消化,模板,DNA,的浓度,0.1,2ug/100ul,体系,PCR,产量随模板,DNA,浓度的增加而显著升高,模板,DNA,浓度过高导致非特异性产物增加,5,Mg,2,浓度,2,Mg,对,PCR,扩增的,特异性,和,产量,有显著,的影响,在一般的,PCR,反应中，各种

12、,dNTP,浓度为,2,200umol/L,时,Mg,浓度为,1.5,2.0,mmol/L,为宜,Mg,2,浓度过高，反应特异性降低，出现,非特异扩增,浓度过低会降低,Taq DNA,聚合酶的活性，使反应产物减少,二,PCR,的反应流程,1,温度与时间的设置,2,循环次数,3,常见问题,1,温度与时间的设置,设置变性,退火,延伸三个温度点,标准反应中采用,三温度点法,双链,DNA,在,90,95,变性，再迅速冷却至,40,60,退火，然后快速升温至,70,75,延伸,对于较短靶基因（长度,100,300bp,可,采用,二温度点法,将退火与延伸温度合,二为一，一般采用,94,变性,65,左右退,

13、火与延伸,变性温度与时间,一般,93,94,1min,足以使模板变性,若低于,93,则需延长时间,但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有,影响,退火,复性,温度与时间,退火温度是影响,PCR,特异性的重要因素,退火温度与时间，取决于引物的长度,碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的,长度,对于,20,个核苷酸,G+C,含量约,50,的引,物,55,作为选择最适退火温度的起点,较为理想,引物的复性温度,通过以下公式帮助选择合适的温度,Tm,解链温度,4(G+C)+2(A+T,复性温度,Tm,值,5,10,在,Tm,值允许范围内，选择较高的复性温度可,大大减少引物和模板间的非特异性结合，提,高,PC

14、R,反应的特异性,复性时间一般为,30,60s,足以使引物与模,板之间完全结合,延伸温度与时间,Taq DNA,聚合酶的生物学活性,70,80,150,核苷酸,S,酶分子,70,60,核苷酸,S,酶分子,55,24,核苷酸,S,酶分子,高于,90,时,DNA,合成几乎不能进行,延伸温度与时间,延伸温度：一般选择在,70,75,之间,常用温度为,72,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合,延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定,1Kb,以内的,DNA,片段，延伸时间,1min,足够,3,4kb,的靶序列需,3,4min,扩增,10kb,需延伸至,15min,延伸时间过长会导致非特异性扩增,对低浓度

15、模板的扩增，延伸时间要稍长些,2,循环次数,循环次数,决定,PCR,扩增程度,循环次数,主要取决于模板,DNA,的浓度,循环次数,选在,30,40,次之间,循环次数越多，非特异性产物的量亦随之,增多,如何提高,PCR,中的,DNA,聚合酶的保真性,在,PCR,反应体系中，除使用,Taq,DNA,聚合酶，掺入,少量的,具有,3,5,外切酶活性的耐热,DNA,聚合酶，如,Pfu,Vent,Pwo,等,错配率可降为原来的,1/10,Mg,2,浓度,尽可能低，但不影响,DNA,合成,减少高温反应时间，这样,DNA,热损伤将减少,减少循环数,如何提高,PCR,扩增的特异性,升高退火温度可增加引物与模板结

16、合的特异性,缩短退火和延伸时间，可减少错误引发及多余的,DNA,聚合酶分子参与酶促延伸的机会,降低引物和酶的浓度也可以减少错误引发，尤其,是能减少引物二聚体的引发,2,改变,Mg,的浓度可进一步提高扩增的特异性,引物设计的特异性,减少循环次数,热启动,Hot,Start,即首先将模板变性，然后,在,较,高,温,度,时,加,入,Taq,DNA,聚,合,酶,引,物,及,MgCl,2,等一些重要成分，这样使得引物在较高温,度下与模板退火，提高了反应的严谨性，使扩增,更特异,采用二对引物即外引物和内引物进行扩增来提高,扩增的特异性,PCR,技术的主要类型,1,反向,PCR,技术,Inverse PCR

17、, IPCR,2,锚定,PCR,技术,Anchored PCR, APCR,3,不对称,PCR,技术,asymmetric PCR,4,反转录,PCR,技术,reverse transcription PCR, RT-PCR,5,巢式,PCR,技术,NEST-PCR,6,多重,PCR,技术,multiplex PCR,7,重组,PCR,技术,8,原位,PCR,技术,9,荧光定量实时,PCR,技术,技术,1,反向,PCR,技术,Inverse PCR, IPCR,反向,PCR,是克隆已知序列旁侧序列的一,种方法,一种在已知序列中无,切点的限制性,内切酶消化基因组,DNA,酶切片段自身环化,以环化

18、的,DNA,作为模板，用一对与已,知序列两端特异性结合的引物，扩增夹,在中间的未知序列,扩增产物是线性的,DNA,片段，大,小取决于上述限制性内切酶在已知基闲,侧翼,DNA,序列内部的酶切位点分布情况,用不同的限制性内切酶消化，可以得到,大小不同的模板,DNA,再通过反向,PCR,获得未知片段,cDNA,末端快速扩增技术,rapid amplification,of cDNA ends,RACE,通过,RT-PCR,技术由已知部分,cDNA,序列来得到,完整的,cDNA5,和,3,端，包括单边,PCR,和锚定,PCR,1,基于蛋白质保守性的兼并引物的设计及,ORF,保守区,RT,PCR,克隆,

19、2. 3,RACE,3. 5,RACE,1,基于蛋白质保守性的兼并引物的设计及,ORF,保守区,RT,PCR,克隆,利用,ncbi,搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或,cDNA,编码的氨基酸,序列因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相,同的，所以氨基酸序列才是真正保守的,对所找到的序列进行多序列对,确定合适的保守区域,设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区,域，且两个保守区域相距,50,400,个,aa,为宜，使得,pcr,产物在,1501200bp,之间，最重要的是每一个保守区域至少有,6,个,aa,残基,因为每条引物至少,18bp,左右。利用软件设计引物,R,A,G,Y

20、,C,T,M,A,C,K,G,T,S,C,G,W,A,T,H,A,C,T,B,C,G,T,A,C,G,D,A/G,T,N=A,C,G/T,密码子的兼并性,氨基酸,密码子数,PCR,技术的主要类型,RT-PCR,及定量,RT-PCR,1,RT-PCR,reverse,transcription-PCR,原理：先在逆转录酶的作用下、以,mRNA,为模板合,成互补的,cDNA,complementary,DNA,，再以,cDNA,为模板进行,PCR,反应,是一种快速、简便、敏感性极高的检测,mRNA,表达,的方法,常用的两种逆转录酶,AMV,avian,myeloblastosis,virus,酶活

21、性最适温度,42,MMLV,Moloney,murine,leukemia,virus,酶活性最适温度,37,2,定量,RT-PCR,qRT-PCR,利用,RT-PCR,对,mRNA,水平进行半定量或,绝对定量分析,半定量,RT-PCR,选用在组织中普遍表达、表达量比较恒定的管家,基因,mRNA,作为内源性基因模板标准,管家基因,mRNA,和目的,mRNA,混合物共同进行逆,转录，在各自的引物引导下扩增,计算出扩增后,目的基因扩增子,管家基因扩增子,的,比值，从而达到半定量的目的,实时荧光定量,PCR,常规定量,PCR,技术,对,PCR,扩增反应的,终产物,进行定量,重复性差,半定量,实时定量,PCR,技术,对,PCR,扩增反应中,每一个循环的产物,进行定量,实时荧光定量,PCR,原理,在,PCR,反应体系中加入荧光基团，利用,荧光信号积累实时监测整个,PCR,进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量,分析,1,Ct,