食品微生物：第四章 食品中的细菌及其检测

1、2/25/2021,1,第四章 食品中细菌及其大肠菌群的检测,食品中细菌菌落总数的测定 食品中大肠菌群的测定,2/25/2021,2,第一节食品中菌落总数的测定,2/25/2021,3,一、菌落总数,GB/T 4789.2-2010:食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得每ml（或每g）检样中形成的微生物菌落总数。 本标准规定的培养条件下所得结果，只包括一群在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数,2/25/2021,4,二、菌落总数测定的意义,1、判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。 2、预测食品存用的期限长短。 3、了解细菌在食品中的繁殖动态,2/25/2021,5

2、,三、菌落总数测定的方法,平板倾注法 平板表面涂布法,2/25/2021,6,四、平板倾注法测定菌落总数,检验步骤(程序)： 检样稀释处理做平板培养菌落计数报告结果,2/25/2021,7,一）、样品稀释及做平板,1ml,1ml,1ml,1ml,1:10,1:1000,1:100,1:10000,1ml,1ml,1ml,加入营养琼脂1520ml,25g 样品,生理盐水,2/25/2021,8,注意：检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min,2/25/2021,9,对照,空白对照：不加样品，反映培养基中的杂质及污染情况 稀释液对照：加1mL无菌稀释液，反映稀释液是否受到污染 无

3、菌操作对照：在空气中暴露30min，反映空气质量和操作技术,2/25/2021,10,二）培养,普通食品: 37 48h ， 倒置放平板 水产品: 30 48h,2/25/2021,11,三）计数和报告,到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于04，但不得超过24h,2/25/2021,12,1、菌落的选择,1）单个菌做一个菌落计 （2）呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算。 （3）如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数,2/25/2021,13,2、平板

4、菌落计数的选择,选取菌落数在30300之间的平板。 （1）、若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内： 计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应的稀释倍数，做为每克（毫升）的菌落总数结果,2/25/2021,14,2、平板菌落计数的选择,2）若有两个连续稀释度的平板菌落在适宜范围： N=C/(n1+0.1n2)d 式中， N 样品中菌落数 C平板菌落数之和 n1第一个适宜稀释度平板数 n2第二个适宜稀释度平板数 d稀释因子（第一稀释度,2/25/2021,15,例,N=C/(n1+0.1n2)d （2322443335）/2+(0.12) 10-2 544/2.2 10-2 247

5、72=25000,2/25/2021,16,3）如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告 4）如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告 5）如菌落数有的大于300，有的又小于30，不在30300之间，以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告 6）如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告,2/25/2021,17,2/25/2021,18,3、菌落数的报告,1）菌落数在1100时，按实际数字报告； 2）如大于或等于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算； 3）所有平板蔓延菌落无法计数，报告菌落蔓延； 4）所有空白对照菌落

6、生长，则检测结果无效； 5）固体检样以克（g)为单位报告， 6）液体检样以毫升（ml）为单位报告， 7）表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告,2/25/2021,19,五、菌落总数Petrifilm测试片法,2/25/2021,20,复习题,1、什么是菌落总数？ 2、测定食品、饮料等产品的菌落总数有什么意义？ 3、画出平板倾注法测定菌落总数的示意图。 4、在测定菌落总数时，如何选择菌落进行计数？ 5、在菌落总数的检验中，要注意哪些事项？ 6、在菌落总数的检验中，如何根据样品的特性选择培养温度和时间,2/25/2021,21,第二节 食品中大肠菌群的检验,2/25/2021,22,一、大肠菌群,1

7、、 什么是大肠菌群？在一定条件下（36条件下培养48h）能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。（GB/T 4789.3-2010） 2、大肠菌群的组成: 大肠埃希氏菌发属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和阴沟肠杆菌,2/25/2021,23,2/25/2021,24,1、粪便污染的指标菌： 大肠菌群,二、大肠菌群的测定意义,2/25/2021,25,2、以大肠菌群作为粪便指标菌原因,在粪便中数量最大； 在外环境中存活的时间与致病菌大体相同； 检测方法简便容易,2/25/2021,26,3、大肠菌群的测定意义 （1）判断食品中否受到粪便污染。 （2）有利于控制肠道传染病的发生

8、和流行。 （3）有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况,2/25/2021,27,三、大肠菌群的生物学特性,1.形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。 2.发酵乳糖产酸产气 3.培养特性,2/25/2021,28,EMB平板照片,在琼脂上的典型菌落: 呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽,2/25/2021,29,麦康凯琼脂平板 Age of culture is 24 h,在麦康凯琼脂上的典型菌落: 呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润,2/25/2021,30,大肠菌群数量的表示方法 1）大肠菌群MPN 大肠菌群MPN是采用一定的方法

9、，应用统计学的原理所测定和计算出的一种最近似数值； 2）大肠菌群菌落数 3）大肠菌群值 大肠菌群值是指在食品中检出一个大肠菌群细菌时所需要的最少样品量。 故大肠菌群值越大，表示食品中所含的大肠菌群细菌的数量越少，食品的卫生质量也就越好：在这两种表示方法中，目前国内外普遍采用大肠菌群MPN，而大肠菌群值逐渐趋于不用,2/25/2021,31,四、大肠菌群检验方法及操作方法,大肠菌群MPN的检验方法,2/25/2021,32,检样,稀释处理,BGLG肉汤,产气,大肠菌群阴性,不产气,接种LST肉汤管,不产气,产气,大肠菌群阳性,查表,报告结果,2/25/2021,33,1:100,1:10,各加入

10、1ml,各加入1ml,各加 入1ml,发酵管,发酵管,发酵管,初发酵,检样稀释,检样量1g/ml,检样量0.1g/ml,检样量0.01g/ml,证实试验,发酵管,查MPN表报告结果,2/25/2021,34,MPN法简介The Most Probable Number Method,2/25/2021,35,1g/ml检样中最近似值(MPN)表,以1、0.1、0.01、各用3管,2/25/2021,36,大肠菌群平板计数法,2/25/2021,37,平板菌落数的选择,选取菌落数在15 CFU150 CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。 典型菌落为紫红色，菌落周围有红

11、色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大,2/25/2021,38,证实试验,从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，36 1 培养24 h48 h，观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性,2/25/2021,39,大肠菌群平板计数的报告,经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为： 1006/10104

12、/g（mL）=6.0105 CFU/g（mL,2/25/2021,40,六、大肠菌群快速检验,食品大肠菌群快速检验方法： TTC显色法 DC试管法 纸片法,2/25/2021,41,三)DC(去氧胆酸钠)半固体试管法,选择三个稀释度的样品液，每个稀释度分别取1ml放入灭菌试管中。将溶化并冷至50左右的DC半固体培养基加入上述试管中，每管3m1。立即混合，凝固后于37培养1824小时。 判定标准和记录： a 培养基变桔红色，有气泡产生或琼脂崩裂。 b 培养基为桔红色，或有桔红色菌落，无气泡和琼脂崩裂现象； c 培养基为绿色，有黄色菌落，无气泡和琼脂崩裂现象； d 培养基为绿色。 判定为a、d反应

13、结果；记录阳性管数，查MPN表并报告之。若为b、c反应结果，可挑大肠菌群可疑菌落接种乳糖复发酵管，根据产酸产气管数查MPN表，并报告之,2/25/2021,42,一）食品饮料大肠菌群快速检验纸片,使用方法： 1.样品稀释同国标法 2.接种： 饮料和饮用水采用原液、1:10、 1:100三个稀释度，固体食品采用1:1 、1:10和1:100三个稀释度。用1亳升灭菌吸管吸取1亳升同一稀释度的稀释液均匀涂布到袋中的纸片上，做三个重复,2/25/2021,43,3.培养： 将接种好的纸片轻轻压平（可叠放），在36下培养1524h观察结果。 4.结果判定: 纸片上出现紫红色斑点,其周围有黄圈者,为阳性.

14、 纸片为一种着色,无菌落生长者为阴性. 纸片呈紫兰色,有紫红色斑点，其周围地黄圈者阴性. 酸性食品接种后,纸片变黄,经培养后无紫红色斑点为阴性,2/25/2021,44,二）餐具大肠菌群快速检验(纸片法,使 用 方 法 ： 1. 采样610份。 碗、盘、杯等每份贴纸片两张，用无菌生理盐水湿润纸片后，立即贴于食具内侧表面，30秒后取下，置于原塑料袋内。筷子以5只为一份样品，用吸管吸取生理盐水湿润纸片后，立即将筷子进口端（约5cm）抹拭两张，放入原塑料袋内,2/25/2021,45,2.将已采样的纸样置于37C培养15小时. 纸片在黄色背景上出现红色斑点为阳性，纸片在紫兰色背景上呈现红色斑点，但周围没有黄晕均为大肠菌群阴性。同一份样品两张纸片均是阴性为合格,2/25/2021,46,食品冷饮大肠菌群检验纸片冷饮、乳制品和调味品等大肠菌群的测定,2/25/2021,47,食品饮料大肠菌群快速检验纸片饮料、食用纯水和糕点的大肠菌群测定,2/25/2021,48,餐具大肠菌快速检验纸片餐具卫生消毒效果检测,2/25/2021,49,三）petrifilm试纸片,2/25/2021,50,LST肉汤管,胰蛋白胨 氯化钠 乳糖 磷酸氢二钾 磷酸二氢