两种多囊卵巢综合征大鼠模型造模方法的比较

1、河南省医学科技攻关基金资助项目8;河南省科技攻关基金资助项目0185;河南省教育厅自然科学研究基金资助项目2010A310014两种多囊卵巢综合征大鼠模型造模方法的比较*贾莉婷1)，刘艳丽1)，马葆靖2)，张展1)，李肖甫1)，赵德华1)，张秋菊1)，郭瑞莹1)，宋晓妍1)，荣守华1)1)郑州大学第三附属医院检验科郑州450052 2)郑州大学第三附属医院保健部 郑州450052女，1958年11月生，本科，教授，研究方向：临床免疫学，E-mail: jialt163 . com关键词 多囊卵巢综合征；来曲唑;脱氢表雄酮；动物模型；雄激素受体；黄体生成素受体 大鼠中图分类号 R711.75摘要

2、 目的：采用来曲唑和脱氢表雄酮(DHEA)建立多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠模型，并 对2种模型进行比较。方法：6周龄和23日龄SD雌性大鼠各60只分别用于来曲唑和DHEA建模，均随机分为实验组、溶剂对照组和空白对照组各 20只；从建模前后大鼠体质量增长、动情周期、卵巢变化、血清性激素水平、卵巢中雄激素受体(AR)和黄体生成素受体(LHR)等指标进行模型评价。结果:2种造模方法的实验组大鼠卵巢颗 粒细胞层明显减少，间质增生。来曲唑造模的实验组实验前后体质量增加量、卵巢体积和相对质量均大于对照组(F =13 .136, 9.778 和6. 544, P均 V 0. 05) ; DHEA 造模的实

3、验组仅卵巢体积小于对照组(F = 19 . 383,P v 0.001)。来曲唑造模的实验组黄体生成素、睾酮(T)含量高于对照组，而卵泡刺激素 (FSH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)低于对照组(P v 0.05);DHEA造模组的实验组血清T、E2高于对照组，FSH低于对照组(P V 0.05)。来曲唑造模的实验组AR、LHR含量均高于对照组(P V 0. 05) ; DHEA 造模的实验组仅 AR高于对照组(P V 0. 05)。结论: 来曲唑大鼠模型更接近于人PCOS特征，是相对理想的 PCOS模型。AR、LHR参与了多囊状卵巢的形成，可作 为PCOS模型蛋白质水平的评价指标。Compar

4、is on of two kinds of polycystic ovary syn drome rat modelsJIA Liti ng1),LIU Yanli1),MA Baojing2),ZHANG Zhan1),LI Xiaofu1),ZHAO Dehua1),ZHANG Qiuju1)GUO Ruiyi ng1),SONG Xiaoyan1),RONG Shouhua1)1) Clinical Laboratory , the Third Affiliated Hospital , Zhengzhou University , Zhengzhou 4500522) Departme

5、nt of Heath Care, the Third Affiliated Hospital , Zhengzhou University , Zhengzhou 450052 Key words polycystic ovaries syndrome; letrozole; dehydroepiandrosterone; animal model; an droge n receptor; lute ini- zing horm one receptor; ratAbstract Aim: To compare two kinds of polycystic ovaries syndrom

6、e rat models induced by letrozole and dehydroepian droster one.Methods: Rats aged six weeks and 23 days( each 60 cases) were admi nisteredletrozole and DHEA respec-tively to in duce PCOS model . In creased weight of rats , oestrous cycle, morphology and histology of ovary , serum hormone levels and

7、the expression of AR , LHR in the ovary were examined. Results:The two experime ntal groups showed less granular cell layer and proliferated mese nchyma in ovary . The in creased weight , volume , andrelative quality of ovaries inletrozole experimental groups were larger than that in control( F = 13

8、 . 136, 9. 778 and 6. 544, P v 0.05) ; In DHEA group ,the volume of ovrian in the experimental group was significantly smaller than in controls( F = 19.383, P v 0.001).Thelevel of luteinizing hormone( LH) and testosterone( T) of letrozole experimental group were sig ni fica ntly higher tha n in cons

9、ols ,serum follicle stimulating hormone( FSH) , estradiol( E2)and progester one( P) of letrozole experime ntal group wassignificantly lower than controls . T and E2of DHEA experimental group were significantly higher than controls, FSH ofDHEA experimental group were significantly lower than controls

10、( P v 0.05).Theexpression of AR , LHR in the ovary ofletrozole experimental group were significantly higher than in controls( P v 0. 05) . In DHEA group, the expression of AR inthe ovary was significantly higher than in controls( P v 0.05) . Conclusion: Comparedwith DHEA groups , PCOS modelinduced b

11、y letrozole in several ways is more similar to the human disease and it is a relative perfect rat model. The ex-538郑州大学学报(医学版)2011年7月第46卷第4期pression of AR, LHR in rat ovary can be evaluated indexes for protein level in PCOS model .多囊卵巢综合征 (polycystic ovary syndrome , P-COS)是育龄期妇女常见的内分泌疾病，其发病率在育龄妇女中为

12、 5%10%1:，发病机制至今尚未明确。现多采用动物模型:2-4 :研究PCOS的病因、发病机制及临床诊断和治疗策略，但模型选择的正确与否直接影响研究结果。来曲唑建模法和脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone, DHEA)建模法是国内外使用较多的2种造模方法：来曲唑通过抑制雄激素向雌激素转化的限速酶芳香化酶的活性，导致体内雄激素的增高，动物选用6周龄SD雌鼠(相当于女性育龄期)；DHEA是胆固醇合成雄激素的中间产物，直接导致雄激素的水平增高，动物选用23 日龄SD雌鼠（相当于女性青春前期）。目前对PCOS模型的 评价多限于动情周期、卵巢形态和组织学以及血清 激素水平等几个方面

13、。作者采用来曲唑建模法和DHEA建模法，在上述评价指标基础上，加入雄激素受体（androgen receptor，AR）和黄体生成素受体（lu- teinizing hormone receptor， LHR）这 2 个指标，评价 2 种模型的差异。1材料与方法1. 1实验动物分别选用6周龄和23日龄清洁级SD雌性大鼠各 60只，均采用随机数字表分为实验 组、溶剂对照组和空白对照组，每组20只购于河南省实验动物中心，许可证号SCXK（豫）2005-0001 。清洁级饲养，环境温度2024 C,湿度 40%60%,每天光照10 h,自由饮水，喂以颗粒饲料。1. 2 PCOS模型的建立1. 2.

14、1来曲唑法 将来曲唑溶于 10 g /L羧甲基纤 维素（CMC）中，实验组大鼠灌胃来曲唑1 mg/（ kg d），溶剂对照组灌胃 10 g / L CMC，均于上午 9时连 续灌服21 d,空白对照组正常饲养。1.2.2 DHEA法将DHEA溶于0.2 mL甘油中,实验组大鼠皮下注射 DHEA 60 mg/（ kg -d），溶剂 对照组皮下注射 0.2 mL甘油，均于上午 10时连续皮下注射21 d,空白对照组正常饲养。1. 3大鼠动情周期及体质量检测每天对大鼠进行阴道涂片，巴氏染色后观察动情周期的变化;每3d测量大鼠的体质量并记录，绘制大鼠体质量的增 长变化曲线。1.4大鼠血清性激素，卵巢体

15、积、相对质量及组织学检查实验组在最后一次应用来曲唑和 DHEA24 h（并禁食12 h）后，对大鼠称量后行乙醚麻醉，快 速心脏取血法致死（对照组选取在动情间期），取血 清置-20 C冻存备用，应用放射免疫法测定黄体生 成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、雌二醇（E2）、孕酮（P）和睾酮（T），试剂盒购自天津九鼎医学生物工程 有限公司。取双侧卵巢，观察卵巢形态学变化、称 量，用游标卡尺测量卵巢长、宽和厚度，计算卵巢体 积5 :;根据大鼠体质量和卵巢体质量计算卵巢相对6:。一侧卵巢置于体积分数为10%甲醛溶液中固定，另一侧卵巢用PBS冲洗后 一80 C冻存备用。以卵巢最大平面作为待检平面行石蜡包埋

16、，每个石蜡块分别以 4卩m厚度切片2次，行HE染色。1. 5大鼠卵巢组织中 AR、LHR蛋白的检测 加入蛋白裂解液研磨大鼠卵巢组织，低温高速离心后取 上清，采用考马斯亮蓝染料结合法检测蛋白浓度。100 g / L SDS-PAGE 分离蛋白质，经 20 V 1 h将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，用50 g/L脱脂奶粉封闭。AR多克隆抗体(SC-816)、LHR多克隆抗体 (SC-25828)均购自美国 Santa Cruz公司，抗体均按1 : 200稀释；内参为3-actin(购自北京博奥森生物 公司)，抗体按1 : 400稀释。经增强化学发光法显 影，用 Biosens Digital Sys

17、tem 分析目的条带灰度值， 以目的条带与lactin灰度值比值作为目的蛋白的相对表达量。1. 6大鼠卵巢组织中 AR、LHR蛋白的定位 应用SP法检测卵巢组织中 AR、LHR蛋白的定位表达，一 抗同免疫印迹法，抗体按 1 : 100稀释。1. 7统计学处理 采用SPSS 16. 0进行分析，应用 单因素方差分析和LSD-t检验分析各组大鼠实验前后体质量增加量、卵巢体积、卵巢相对质量、血清性 激素水平、AR和LHR蛋白相对表达量的差异，检验 水准 a =005。2结果2. 1 PCOS模型大鼠动情周期观察 来曲唑造模的实验组大鼠在灌胃12 d后全部失去规律性动情周期，阴道涂片的细胞学特征为大量

18、的白细胞，均 处于动情间期时相；DHEA造模的实验组大鼠动情 周期变化极不规律;各对照组均保持规律的动情 周期。2. 2各组大鼠实验前后体质量增加量、卵巢体积和卵巢相对质量比较见表1。Journal of Zhengzhou University( Medical Sciences) Jul .2011 Vol. 46 No . 4 539 表 1 各组大鼠实验前后体质量增加量、卵巢体积和卵巢相对质量比较组别n来曲唑法DHEA法实验前后体质量增加量/g卵巢体积/ mm3卵巢相对质量/10-5实验前后体质量增加量/g卵巢体积/ mm3卵巢相对质量/10-5实验组 20 95. 60 9. 56

19、0. 084 . 008 9. 80 . 80 123. 15 . 59 0. 049 . 00617.95 .19溶剂对照组 20 70.86 7.380.*073 .00516.*40 .2212 8.*90 .86 0 .056 .00616.80 .48空白对照组 20 72.*07 4 .280.*075 .00517.*60 .34126.*65 .54 0 .058 .00416.40 .37F 13136 9.778 6544 2 .890 19 .383 2 .187P v0. 001v 0 .001 0 .004 0 .083 v 0 .001 0 .127*与实验组比较，

20、 P v 0.05。2. 3各组大鼠卵巢形态学、组织学观察来曲唑造模的实验组大鼠卵巢表面较苍白、包膜增厚，可见大 量囊状卵泡形成；DHEA造模的实验组大鼠卵巢表 面苍白，囊状卵泡凸起不明显 ；各对照组大鼠卵巢红 润。来曲唑造模的实验组大鼠卵巢颗粒细胞层减至 23层，间质细胞增生明显，卵泡内卵母细胞多数 缺失，稀见排卵前卵泡和黄体，可见大量囊状扩张卵 泡；DHEA造模的实验组卵巢颗粒细胞层减少的程 度没有来曲唑造模的实验组减少的显著，白膜增厚 和间质增生不明显；各对照组卵巢颗粒细胞呈多层， 多为89层。见图1。2. 4各组大鼠血清性激素水平比较见表2、3。图1各组大鼠卵巢组织组织学变化 （HE

21、, M00）A:来曲唑造模的实验组大鼠；B: DHEA造模的实验组大鼠；C:对照组大鼠。 表2来曲唑造模各组大鼠血清性激素水平比较组别nP ( T) /(卩 g L-1)LH /(U L-1)FSH /(U L-1)P ( E2)/(ng L-1)P ( P) /(卩 g L-1)LH/FSH实验组20 1.76 .30 5. 70 .68 0.95 =0. 24 7.69 . 72 29.34 ,73 6.39戈.33溶剂对照组*20 0. 37 . 064.42 .*071.64 =.*9910.14 .*1839.10 .*053.43 1.*81空白对照组*20 0. 36 . 064

22、.56 .161 .*55 .3811 .85翌.41*34 .40 .05*3 .13 .84*F 197. 484 4. 568 6. 861 15. 104 9. 381 12. 977P v 0. 001 0. 017 0. 003 v 0. 001 0. 001 v 0. 001*与实验组比较，P v 0. 05。表3 DHEA造模各组大鼠血清性激素水平比较组别nP ( T) /(卩 g L-1)LH /(U L-1)FSH /(U L-1)P ( E2)/(ng L-1)P ( P) /(卩 g L-1)LH/FSH19实验组 20 1.36 .32 3.60 .96 0 .96

23、.47 18 .48 .24 32 .95 4 .29 .63溶剂对照组 20 0 .36 .03*4 .31 .33 1 .40 .79*12 .52 .0734.88 .96 3.41 1.41空白对照组 20 0.34 =.06*4.*35.19 1.41 .2811.*21=3.7632.91.38 3.37 .08F 90.692 2.550 3.471 5256 0 .259 0 .149P v0.0010.092 0.042 0.010 0774 0.862*与实验组比较， P v 0. 05。2. 5大鼠卵巢组织中 AR、LHR的表达情况 见图2、3及表4。AR主要表达于卵巢颗

24、粒细胞的胞核，呈棕黄色着色，2种造核方法的实验组表达量高于对照组。LHR表达于卵巢颗粒细胞的胞质及内、外膜层细胞的胞质，来曲唑造模的实验组表达量高于对照组，DHEA造模的实验组表达量略低于对照组。 540郑州大学学报（医学版）2011年7月第46卷第4期图2各组大鼠卵巢组织AR（A）、LHR（B）的表达（SP, 400）1:来曲唑造模的实验组大鼠；2: DHEA造模的实验组大鼠；3:对照组大鼠。图3来曲唑法（上）和DHEA 法（下）大鼠卵巢中 AR、LHR 表达的 Western blot检测A:实验组；B:溶剂对照组；C:空白对照组。表4各组大鼠卵巢组织中 AR、LHR蛋白相对表达量比较组别

25、来曲唑法DHEA法AR LHR AR LHR实验组 0. 874 =0. 021 0. 798 . 043 0. 845 =0. 048 0. 697 . 072溶剂对照组0 .*815 .0240 .687 .037*0 .802 .040*0 .716 .061*空白对照组0 .*809 .0230 .705 .042*0 .793 .051*0.710 .068F 21.988 33.032 5.401 3.593P v 0.001 v 0.001 0.009 0.038*与实验组比较， P v 0.05。3讨论依据PCOS的诊断标准3:，结合该研究结果，从以下几方面比较 2种模型：来曲

26、唑造模的实验组每 次所测定体质量均大于对照组，且实验组体质量增 长量明显高于对照组，这与PCOS患者多表现肥胖相符；DHEA造模的实验组大鼠体质量增长量稍低 于对照组，该法不适合于研究肥胖患者。2种方法造模的实验组大鼠失去规律的动情周期，提示无排 卵。2种造模方法大鼠卵巢均发生了多囊状改变， 来曲唑造模的实验组大鼠卵巢形态学和组织学变化 较DHEA造模的实验组大鼠更为典型，更适合于卵 巢形态学的研究。来曲唑和DHEA均可诱导一种高雄激素的状态。来曲唑造模的实验组大鼠P水平下降，提示不排卵，和人PCOS 一致7 :。在PCOS中，血清LH 升高是由P或E2所介导的LH负反馈8:。来曲唑通过减少下

27、丘脑-垂体轴E2的产生增强了 LH分泌，是一种双重效应。PCOS患者血清 LH、LH/FSH异常升高，促进卵 泡内膜细胞以及间质细胞合成过多雄激素，导致窦卵 泡募集亢进，最后卵泡发育停滞，来曲唑造模的实验 组充分证明了这点。但来曲唑造模的实验组大鼠E2水平下降，不适合研究雌激素水平较高的PCOS;而DHEA造模的实验组大鼠血清E2水平明显增高，适合于雌激素水平较高的 PCOS患者研究。 AR是一种配体依赖性的反式转录调节蛋白。 PCOS病理状态下，体内的高雄激素环境可引起胞质内AR的核内输入，使核内 AR水平提高，与免疫 组化结果一致。AR 一旦被雄激素激活便能识别靶 因子上专一的 DNA序列

28、并与之结合，从而调控该基 因转录，表达新的蛋白质，最终使得细胞的功能发生 改变，靶器官卵巢则出现多囊状卵泡的形成。2种造模方法的实验组大鼠AR均高水平，表明高水平的T和AR结合后参与了多囊状卵泡的形成。文 献:9-10:通过给雌性大鼠持续应用来曲唑，导致大鼠 出现排卵障碍、卵巢多囊样变，卵巢中AR表达量增加，与该实验结果相符。血清中LH与卵泡膜细胞LHR结合，激活腺苷酸环化酶系统而刺激甾体激素 的合成，参与女性生殖过程，如受精卵着床、性腺发Journal of Zhengzhou University( Medical Sciences) Jul .2011 Vol. 46 No. 4 541

29、 育及功能活动的调节。PCOS患者血清LH升高可通过诱导卵泡膜细胞表达LHR增加，LHR在PCOS患者卵泡颗粒细胞中表达增加可认为导致颗粒细胞 发生分化、卵泡发育停滞，持续性无排卵的一个指标。Jakimiuk 等11报道PCOS患者的颗粒细胞和卵泡膜细胞中LHR mRNA的高表达，与作者的实验结 果相一致。总之，两模型结果表明大鼠卵巢中AR、LHR参与了多囊状卵巢形成，可作为 PCOS模型蛋 白质水平的评价指标。综上所述，无论从传统的动情周期、解剖学、组织 学、血清学等方面，还是从增加的蛋白质水平比较，来 曲唑造模法模型大鼠病理生理特征更接近于人类P-COS特征，是研究该病较为理想的动物模型，

30、且较 DHEA皮下注射法对大鼠创伤性小，操作简便。参考文献1 Yavasoglu I, Kucuk M , Coskun A, et al. Polycystic ovarysyn drome and prolact inoma associati on J. In ter Med ,2009, 48(8):611:2 胡颜霞，张展，贾莉婷，等.来曲唑诱导多囊卵巢综合征大鼠模型的研究J.中国妇幼保健，2006, 21( 7) : 957:3 任伟慧，贾莉婷，张展，等.来曲唑诱导的多囊卵巢综合征大鼠卵巢组织中角质细胞生长因子的表达J.郑州大学学报：医学版，2008, 43( 3) : 532:4

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