蒋3卵巢上皮癌组织中

1、卵巢上皮癌组织中ERCC基因mRN表达水平与患者化疗反应性和生存期的关系、尸 、-前言卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌是妇产科最常见的三大恶性肿瘤，随着宫颈 癌和子宫内膜癌的早期诊断和治疗已经取得了巨大的进步， 卵巢癌已经成为严重 威胁女性生命的恶性肿瘤，发现之时多已处于晚期，五年生存率一直在25%30%徘徊1-3。以铂类药物为基础的化学治疗是卵巢癌除手术之外的主要辅助治 疗手段，既可用于预防术后的复发， 也可用于手术未能全部切除者， 部分患者可 获暂时缓解，甚至长期存活。然而有 20%到30%的患者对一线化疗药物始终无 反应，初治有反应的患者仍有部分会发生继发耐药。研究表明，铂类药物的耐药和核酸切

2、除修复系统 (nucleotide excision repair, NER)密切相关，NER系统可以修复铂类化疗药所造成的 DNA损伤，从而降低 患 者 对 化 疗 的 敏感 性 4-9 。 切 除 修 复 交叉 互补 基 因 1(excision repair cross-complementation group 1 ERCC1)是NER系统中的一个关键基因，其表达 量与肺癌、胃癌、前列腺癌患者的预后相关。 ERCC1 基因共 10个外显子，可分 别转录为两个剪接体，含 10个外显子的全长剪接体 mRNA (full length, FL), 和缺 失第VHI外显子(长72bp)的变异剪

3、接体 mRNA( alternative splicing, AS)。本研 究使用TaqMan实时荧光定量RT-PCR法检测卵巢癌组织中ERCC1的变异剪接 体的表达量，以期对此变异剪接的临床意义进行探讨。试验流程纳入卵巢癌组织63例TRIzol提取总RNA提取逆转录为CDNATaqMan实时荧光定量检测统计分析1材料与方法1.1纳入标准：我院自2000年1月至2006年12月所收治的原发性卵巢上皮癌患者，术前 未接受化疗，术后经病理确诊。全部标本均经病理科医师切片确诊， 病理科医生 并不知道病人纳入与排除的情况，充分使用了盲法。术后至少接受3个疗程的以 铂类为基础的化疗。术前均签署知情同意书

4、，允许所切除卵巢组织保存于我院并 被用于科学研究。1.2排除标准：接受术前化疗者；卵巢非上皮性癌者；病例资料不完整者；切除卵巢组织 未行保存或者保存不善以致无法提取 RNA者；拒绝将切除组织用于科研者。符合以上纳入与排除标准者共计63例卵巢上皮癌患者纳入研究。1.3诊断标准：全部标本均经病理科医师切片确诊。组织学分级标准主要依据世界卫生组织(World Health Organization, WHO) 1973年制定的卵巢组织学分类法进行组织学的分类和分级，并参照细胞分化程度分 3级：分化1级，为高度分化； 分化2级，为中度分化；分化3级，为低度分化。卵巢恶性 肿瘤的病 理分级、分期根据 国

5、际妇产 科联盟(F由nationInternationale de Gyn cologie et dObst triqu, FIGO) 2000 年修订的临床分期标准来判断临床期别：卵巢恶性肿瘤的手术-病理分期TNMFIGO0原发肿瘤无法评价无原发肿瘤证据TXT0I肿瘤局限于卵巢T1I a 肿瘤局限于一侧卵巢，包膜完整，表面无肿瘤，T1a腹水或腹腔冲洗液中未查见恶性细胞。I b 肿瘤局限于两侧卵巢，包膜完整，表面无肿瘤，T1b腹水或腹腔冲洗液中未查见恶性细胞。I c 肿瘤局限于单侧或双侧卵巢，伴有以下任何一项者：T1c包膜破裂、卵巢表面有肿瘤、腹水或冲洗液中有恶性细胞。肿瘤累及一侧或双侧卵巢，

6、伴盆腔内转移。T2肿瘤蔓延和/或转移到子宫和/或输卵管,T2a腹水或冲洗液中无恶性细胞。肿瘤蔓延到盆腔其它组织，腹水或冲洗液中无恶性细胞。T2bn a或n b病变，但腹水或冲洗液中查见恶性细胞。T2b川肿瘤侵犯一侧或双侧卵巢，镜检证实盆腔外有腹膜转移T3和/或N1和/或区域淋巴结转移。川a 镜检证实盆腔外腹膜转移超出盆腔外。T3a川b盆腔外腹膜大块转移灶最大径线w2cmT3b川c盆腔外腹膜转移灶最大径线 2cm,T3c和/或N1和/或区域淋巴结转移IV 远处转移(腹膜转移除外)M1注：肝包膜转移为T3/川期，肝实质转移为 M1/V期。胸膜渗出液必须有阳性细胞才能分为M1/V期。NO-无区域淋巴

7、结转移， N1-区域淋巴结转移。 M0-无远处转移，M1-远处转移(腹膜转移除外)。1.4化疗效果判断标准：判断标准参照曾益新主编的肿瘤学第2版第410页，以临床检查，CA-125和影像学检查结果来判断，肿瘤完全消失超过一个月为完全缓解(complete remissi on, CR)肿瘤体积缩小超过 50%且持续一个月以上为部分缓解(partial remission,PR);肿瘤体积增大超过50%或有新病灶的出现为进展(progressive, P ;肿瘤体积变化不超过25%为稳定(Stable, S)。对化疗敏感的定义：完全缓解与部分缓解均为敏感，对化疗有反应。对化疗耐药的定义：进展与稳

8、定均为耐药，对化疗无反应。随访：生存时间的计算方法为从接受治疗之初到随访结束或者死亡之时。经门诊随访或者电话和信件随访。1.5主要仪器超速低温离心机 德国西门子公司TGL-16C台式高速离心机 上海安亭科学仪器厂Gel doc 2000凝胶成像分析系统- 美国 Bio-Rad 公司紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司普通PCR扩增仪 美国热电公司Thermo electron corporationOLYMPUS光学显微镜 日本OLYMPUS司恒温水浴箱 国产冰浴加样盒 国产桥式水平电泳仪槽 北京崇文东方仪器厂DYY- 型稳压稳流电泳仪 北京六一仪器厂Eppendorf 管 国产各

9、式微量移液器 美国 Gilson 公司超低温冰箱 中国海尔公司Chromo4 Real-Time PCR Detector 实时荧光定量 PCR 仪 购自美国Bio-rad 公司；荧光定量PCR管0.2ml薄壁美国Cepheid公司Smartcycler1.6 主要试剂及配制(1) TRizol 试剂 购自 Invitrogen 公司(2) First Strand cDNA Synthesis Kit 逆转录试剂盒 购自 MBI Fermentas 公 司，内含：M-Mulv 反转录酶Oligo(dT)18 (0.5 卩 g/ 卩 l)高浓度 dNTP 10mM dNTPRNA 酶抑制剂 R

10、nasin inhibitor5 Xeact ion buffer(3) Taq PCR Master Mix 购自(4) 异丙醇、无水乙醇(5) 焦碳酸二乙酯 (DEPC)(6) 三氯甲烷(氯仿)(7) 溴化乙锭 EtBrTIANGEN 生物有限公司 国药集团化学试剂有限公司 上海生物工程公司东风化工厂上海生物工程公司(8) 琼脂糖上海捷瑞生物技术公司(9) 50X TAEBIOWEST AGAROSE 公司(10) 50bp Ladder DNA Marker 购自 大连宝生物公司1.6.1 主要试剂的配制(1) 0.1%DEPC 水配制0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)是RNA酶的强烈抑制

11、剂，所有接触RNA的器 具均需经过含0.1%的DEPC的水浸泡过夜以便去器具上面沾染的 RNA酶，浸泡 后高温高压消毒。1000ml双蒸水中加入1ml DEPC，充分震荡混匀，配制成含0.1%DEPC的水 备用。含0.1%DEPC的水放置过夜，大概16小时后，吸取100ml，经高温高压30min 后，即可除去DEPC，成为不含RNA酶的水。可用于RNA的提取和逆转录。(2) RNA 酶的去除RNA酶可以降解RNA,破坏RNA的完整性，影响试验结果，所以在提取RNA 的整个过程都要严防 RNA 酶的存在。为减少 RNA 酶的污染，所用的 Tip 头、 Eppendof离心管等塑料制品均先用 0.

12、1%二乙基焦碳酸酯(DEPC水)浸泡过夜， 后高压消毒除去残存的DEPC，进口塑料管已经过射线消毒，可直接使用；其它 玻璃、陶瓷器皿均需先水洗晾干后，再经重铬酸钾 -硫酸洗液浸泡过夜，洗净后 200E干烤4-6小时，方能使用。所以物品均现配现用。(3) EtBr 溶液的配制溴化乙锭 EtBr 是有毒物质，皮肤不可以直接接触，整个配置过程都要戴橡 胶手套，在通风厨中进行。配置的溴化乙锭贮存浓度为10mg/ml，工作液的浓度为 200 卩 g/ml。首先将溴化乙锭0.5g溶解于50ml三蒸水中，充分搅拌溶解后放置于棕色瓶 中4C避光保存。使用时取10mg/ml的贮存液200卩l稀释于10ml三蒸水

13、中。(4) 50X TAE 电泳缓冲液的配制0.5mmol/L EDTA（PH=8.0）5.0ml冰醋酸2.9ml首先称取Tris12.1g加入40ml三蒸水中，依次加入0.5mmol/L EDTA（PH=8.0） 5.0ml，冰醋酸2.9ml，充分搅拌溶解后用三蒸水补足至 50ml，高压灭菌后室温 保存，作为贮存液。使用时，取 20ml加蒸馏水至1000ml，即得1XTAE的工作 液。（5）不同浓度琼脂糖凝胶配制 1 .0琼脂糖凝胶50ml琼脂糖0.5g1 XTAE50ml 1 .5琼脂糖凝胶50ml琼脂糖0.75g1 XTAE50ml称取所需剂量的琼脂糖粉末，加入所需体积的 TAE 缓冲液

14、中，置于微波炉 中间断加热， 使琼脂糖完全溶解， 其间不断缓慢摇动锥形瓶， 使贴于壁上的琼脂 充分溶解。冷却至50E左右，加入200卩g/ml溴化乙锭（EB液）125卩l混匀（使终 浓度为0.5卩g/ml）。2 方法2.1试验前RNA酶的去除：采用Trizol试剂一步法提取卵巢组织 RNA :为减少RNA酶的污染，该方 法中所用的 Tip 头、 Eppendorf 离心管等塑料制品均先用 0.1%二乙基焦碳酸酯 （DEPC水）浸泡过夜，高压消毒除去残存的 DEPC。进口离心管已经过射线消毒， 可直接使用；其它玻璃、陶瓷器皿均需先水洗晾干后，再经重铬酸钾-硫酸洗液浸泡过夜，洗净后200r干烤46

15、小时，方能使用。一般去除 RNA酶的用具立 即使用。人的皮肤是 RNA 酶污染的重要来源，用具处理过程中和试验过程中均 主意戴手套和帽子。空气中含有 RNA 酶，去除 RNA 酶的用具需要用布包裹， 容器需要盖上盖子，且不宜放置过久。2.1.2 总 RNA提取RNA是极易受到RNA酶的降解，在提取RNA过程中最关键的是抑制 RNA 酶活性,所以的用具均需经过含 0.1%DEPC 的水浸泡过夜后高温高压消毒。 RNA 提取基本原理是通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提 RNA ，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。已经有商品化的 RNA 提取试剂盒 出售，如美国Invitroge

16、n公司的TRIZol和日本Takara公司的RNAiso。本试验采 用美国Invitrogen公司的TRIZol试剂提取RNA oTRIZol为高浓度强变性裂解液， 可迅速破坏细胞结构， 使 RNA 从细胞中释放出来， 同时 Trizol 试剂还含有 Rnase 抑制剂使细胞内 RNA 酶失活， RNA 不被降解，同时氯仿能将细胞碎片、 DNA、 蛋白质与RNA分离开来，得到纯化的总 RNA，焦碳酸二乙酯(DEPC)是一种强 烈的 RNA 酶抑制剂，用它来浸泡实验所用器具，及配制 70%乙醇，保证实验过 程不产生RNA酶污染，并且使所得RNA有较高的纯度，几乎不含有基因组DNA。实验步骤：本次

17、研究采用美国 Invitrogen 公司生产的 Trizol 试剂一步法提取卵巢组织总 RNA，以便得到高质量的RNA，对卵巢癌组织中的目的 mRNA进行定量分析。 具体步骤如下：(1) 从液氮罐内取出保存的卵巢癌组织，并逐一核对住院号和姓名，剪取 约 200mg 卵巢癌组织迅速置于液氮中，在液氮中使用研钵将卵巢癌组织研磨成 粉末后加入Trizol试剂1mL，充分混匀。Trizol充分溶解后的卵巢癌组织浆转入 1.5mL离心管中，加0.25mL氯 仿，充分振荡混匀，冰浴 15min。(3) 在 4C低温 13000rpm，离心 15min。(4) 小心吸取上层水相至另一 1.5mL 离心管中，

18、 RNA 存在于上层水相，在 吸取时注意不要吸到蛋白层或有机相， 以免蛋白等杂质的污染。 加等体积异丙醇， 摇匀，室温放置10min，在4C低温13000rpm,离心15min，沉淀RNA。(5) 加70%乙醇漂洗沉淀，在4C低温5000rpm,离心10min，小心弃去乙 醇，空气中干燥 10min。(6) 加入40 pl经DEPC处理过的，不含RNA酶的双蒸水完全溶解总 RNA。2.1.3总RNA勺定量及纯度测定:为了检测所提取RNA的纯度和质量，使用紫外分光光度计测量RNA溶液的吸光值，并使用琼脂糖凝胶电泳检测条带。(1) 总RNA定量分析：用ddH20稀释3丄RNA样品至150，充分混匀

19、； 用紫外分光光度仪测总 RNA的OD260、OD280的吸光值，计算0D260/0D280 比值，比值大于1.80,表明纯度符合要求，如低于此值，表明存在蛋白质污染， 需重新用酚/氯仿抽提。通过OD260值计算RNA总浓度：总 RNA 浓度(ug/ L)=(A260 X 40X 稀释倍数)/1000(2) 琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性：选用专用电泳槽、制胶板、梳子，先用无水乙醇擦洗，晾干后用 0.1% DEPC处理过的ddH2O彻底冲洗，再用无水 乙醇洗一次，待乙醇挥发后即可使用。制备1%琼脂糖凝胶，其中含有0.5卩g/ml 的溴化乙锭以便使PCR产物在紫外灯下显色。取2此总RNA溶液加

20、1此上样 缓冲液点样，以5V/cm稳压电泳，紫外灯下可见 28s、18s、5s三条rRNA的清 晰条带，但是有时5s条带并不能总是理想的显示，本次研究所纳入的卵巢癌组 织有些在液氮中保存时间很久，有些不能清晰的显示5s的rRNA条带。结果见图。t2Ss rRNA . . . .rRNA-5s rRNABio-rad凝胶成像仪成像，使用quality-one软件分析知其28S条带亮度是18S亮度的2倍。表明RNA提取的质量很好，可以用于本次研究2.2 逆转录 cDNA2.2.1 逆转录引物的选择：以提取到的总 RNA 作为模板，使用引物和逆转录酶逆转录成 cDNA. 通常可 以选用的引物有三种：

21、1. 胸腺嘌呤寡聚体 Oligo （ dT）182. 随机六聚体引物 random hexamer primer3. 序列特异的引物 sequence-specific primer细胞内的mRNA在3端为polyA , Oligo （dT）佗作为引物与polyA互补， 使用 Oligo（dT） 1 8作为引物能够将所提取的总 RNA 中含有 polyA 的 mRNA 逆 转录为cDNA，所得到的cDNA利于后续的PCR扩增基因全长，利于构建基因 全长的载体，而且对于引物与总RNA的比例要求不严体，不需要对引物与总RNA 的比例进行优化。随机六聚体引物为四种脱氧核糖核酸（A,T,G,C）的随机

22、组合，使用此引物逆转 录的 cDNA 长短不一，随机六聚体引物与总 RNA 的物质的量的比例对所得到的 cDNA 长度有关键性的影响，提高引物与总 RNA 的比例能够得到较短的 cDNA 产物，通常小于 500bp; 如果降低引物与总 RNA 的比例则使长的 cDNA 产物增 长。因此实验前对随机六聚体引物与总 RNA 的比例进行优化是必要的。序列特异的引物则适用于单管RT-PCR（o ne tube）逆转录的引物是针对目的基因而设计的。Oligo（dT）佗与随机六聚体引物适用于两管 RT-PCR。（tow tube）.本研究采用两管 RT-PCR 法，使用随机六聚体引物 random hex

23、amer primer 作为逆转录引物以便得到较多的 cDNA 产物。2.2.2 逆转录酶的选择目前广为使用的逆转录酶是四种，具体如下：1 Money 鼠白血病病毒( MMLV )反转录酶：有强的聚合酶活性， RNA 酶H活性相对较弱。最适作用温度为 37C。2 禽成髓细胞瘤病毒( AMV )反转录酶：有强的聚合酶活性和 RNA 酶 H 活性。最适作用温度为42C。3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：2+在 Mn2+ 存在下，允许高温反转录 RNA ，以消除 RNA 模板的二级结构。4. MMLV 反转录酶的RNase H

24、-突变体：商品名为SuperScript和SuperScriptU。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的 mRNA 模板合成较长 cDNA。本次研究采用 Fermentas 公司的 Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase (M-MuLV RT),此酶具有低的RNase H活性,以便从较长的模板(最 长可达13kb)中得到全长cDNA序列。2.2.3 具体步骤详细叙述如下：所有操作均在冰上进行。在 0.5ml Eppe ndorf管内加入以下反应体系： 总RNA0.5-5

25、用随机六聚体弓丨物 random hexamer primer 1JRNase free水至总体积12 d稍离心混匀后，70r反应5分钟，立即置于冰上冰浴5分钟 依次加入以下各成分：5 Reaction Buffer4 d10mMdNTP Mix2dlRNA 酶抑制剂(RiboLock Ribonuclease inhibitor)(20u/ d)1 d稍离心混匀各成分，由于使用了随机六聚体弓物 random hexamer primer ， 故此步骤在25C下反应5分钟。 加逆转录酶 M-MuLV(200u/dl)1dl由于使用了随机六聚体弓物 random hexamer primer ，

26、故此步骤首先在 25r反应10分钟，然后在42C反应60分钟72 C 10分钟灭活逆转录酶 迅速置于冰浴中5分钟，以防cDNA结合成双链 -20 C保存质量检测：制作含有0.5卩g/ml溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶，然后加入逆 转录产物4J及上样缓冲液2ul，电泳使溴酚蓝前移2cm左右，凝胶成像分析仪 可见较宽的电泳区带呈片状。2.3 TaqMan实时荧光定量PCR实验原理：定义：实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团， 利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行 定量分析的方法。实时荧光定量PCR技术是DNA定量技术的一次飞跃。运用 该项技术

27、，可以对 DNA、 RNA样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝 对定量分析和相对定量分析。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度；后者可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水平进行比较。除此之外还可以对PCR产物或样品进行定性分析：例如利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物 二聚体，以区分非特异扩增；利用特异性探针进行基因型分析及SNP检测等。目前实时荧光PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究 及药物研发等领域。原理：聚合酶链式反应（PCR）可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增 。 在扩增反应结束之后，可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过放射性核素掺入

28、标记后的光密度扫描来进行定量的分析。无论定性还是定量分析，分析的都是PCR终产物。而实时荧光定量PCR则是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定 性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一 个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变 化，从而得到一条荧光扩增曲线图：CycleFig Threshold value curve and CT value曲线阈值与Ct值荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指

29、数扩增 阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖， 无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，所以 PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。为了 定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR技术中引入了两个非常重要的概念： 荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以 设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上， 每个反应管内的荧光信号到达设定的 域值时所经历的循环数

30、被称为 CT值(threshold value )。CT值与起始模板的 关系研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线， 其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。50.00 -45 0C -40.DG -K0QJO 00 -25 00 -20 001500 -10.00 - 5 00 -0 00-5 00 -Standard CsFve - i#st37Fig Stan dardard curve实时荧光定量PCR的标

31、准曲线实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利 用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料 或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。 前者由于增加了探针的识别步骤，特异 性更高，但后者则简便易行。SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链 DNA结 合染料。与双链 DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物 的检测非常理想。SYBR Green I的最大吸收波长约为 497nm，发射波长最大 约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量 SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入 DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的

32、SYBR染 料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR Green I在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双 链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性且价 格相对较低。利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体， 因而可以、区分非特异扩增，进一步地还可 以实现单色多重测定。此外，由于一个 PCR产物可以与多分子的染料结合，因 此SYBR Green I的灵敏度很高。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由 SYBR Green I得到定量结果。DenatureI丨11丨丨丨

33、I丨11丨门丨丨11 M丨I丨11丨I丨I丨I IF1丨丨障1川.丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨.丨丨 丨丨丨I丨.1. An rwal:“hihh*匸I门一山 Extend一般而言，探针法比染料法（如 SYBR Green I）最广泛使用的TaqMan探 针就是运用了这个原理。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的 荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧 光基团，此时5端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的 3端荧光淬灭基 团（发生荧光共振能量转移，FRET）,因此探针完整时，检测不到该探针 5端 荧光基团发出的荧光。但在 PCR 扩增中，溶液中的模板变

34、性后低温退火时，引 物与探针同时与模板结合。 在引物的介导下， 沿模板向前延伸至探针结合处， 发 生链的置换，Taq酶的5 -3外切酶活性（此活性是双链特异性的，游离的单 链探针不受影响）将探针5端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应 体系中，从而脱离 3端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号，即每 扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成， 实现了荧光信号的累积与 PCR 产物 形成完全同步。1. Polymerization: A fluorescent reporter (R) dye and a quencher Q) are attached to the 5 and

35、3 ends of a TaqMans probe, respecttvely.FORWARD PfllMERQ PflDBt35*513r51REVERSE PRIMER2. Strand displacement: When the probe is intact, the reporter dye emiston is quenched.5*-3151-9r53513- Cleavage: During each extension cycler the DNA polymerase cleaves the reporter dye from| the probe.53*5*S5*4.

36、Polymerization completed: Once separated from the quencher, the reporter dye emits its characteristic fluorescence.515*3*512.3.1引物设计和内参基因的选择为了去除不同标本在RNA的产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别而获得目标基因特异性表达的真正差异，通常选择一定的内参基因进行校正和标 准化。内参基因扩增中的变化可以反映 RNA产量、质量和/或cDNA合成效率的 变化。选择适当的内参基因以减少检测标本间的差异是必须的。 内参基因应具备 的条件理想的内参基因应该满足以

37、下条件： 不存在假基因(pseudogene)以避免基因组DNA的扩增； 高度或中度表达，排除太高或低表达； 稳定表达于不同类型的细胞和组织(如正常细胞和癌细胞),而且其表达量 是近似的，无显著性差别； 表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关； 其稳定的表达水平与目标基因相似； 不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响。排除内参基因的条件则为： 在正常和异常的细胞/组织中的表达存在差异； 呈现细胞周期依赖的表达； 定位于X染色体。本次研究选择人beta-actin作为内参基因，可以满足以上条件。采用第二章已经建立起来到 TaqMan实时荧光定量RT-PCR平台，设计的Ta

38、qMan探针和引物如下：引物名称序列（53引物特征产物长度bpTERCC1ATACCCCTCGACGAGGATGAG第II外显子末端77ACAGTGGGAAGGCTCTGTGTAGA第III外显子始端FAM- CGGAATAAGGGCTTGGCCACTCCA-TAMRA第II与III外显子连接处ASERCC1CCAGCGGACCTCCTGATG第VII外显子末端151 和79*CTCTTGA TGCGGCGATGAG第IX外显子始端FAM-AGGACTTCGTCTCCCGGTCTCTGGAAC-TAMRA第VII与IX外显子连接处TaqMan beta-actinGGCACCCAGCACAAT

39、GAA1898GGAAGGTGGACAGCGAGG18FAM-CAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC-TAMRA25232引物和探针的溶解稀释由于合成后的引物Olig Primer和Probe呈膜状附在管壁上，在使用前先瞬 时离心，再轻轻打开管盖。加入灭菌的去离子水，稀释成100卩mol/nh的贮存液, 在使用前调整终浓度至所需的浓度，置于-20C保存。在稀释成工作液时，使Primer的浓度为50卩mOl, Probe的浓度为10卩mol/。2.3.3标准品的构建与标准曲线的扩增将构建成果的质粒转化入大肠杆菌后提取质粒，按10倍浓度梯度依次稀释做为标准品，以此为模板制作标准曲线。每

40、个标本均在三个反应体系中同时用三 套引物进行扩增，每个标本重复三次。每次均同时设置3个标准曲线。每个组织 标本的ERCC1的拷贝数除以其内参beta-actin的拷贝数，其商值作为统计分析的 数值。标准品的构建详见第二章。2.3.4 TaqMan实时荧光定量PCR检测mRNA表达水平首先将整个反应条件进行优化，优化后的分析效率在 95%105%，且相关 系数在0.901.00之间，每个10倍的浓度梯度之间的Ct值相差在3.3左右，标 准曲线的斜率在-3.0左右。在冰上溶解所需试剂，使用cool start技术避免非特异性扩增。TaqMan探针 注意避光，配制过程中将PCR反应管用锡箔纸包裹避光

41、。在冰上配制如下试剂：试剂体积（卩l）丫 Taq酶(5U?卩 I-1)0.2510X PCR Buffer (Mg2 Free)51MgC2(25mmo?l )3dNTP Mixture(各 2.5 mmol?l-1)4模板质粒5-1Primer Forward (50 卩 mol?l )-1Primer Reverse (50 卩 mol?l )TaqMan Probe(10卩 mol/l)无菌水112.5加水至50卩lTaqMan荧光定量PCR反应温度和时间控制：95C预变性3min；94C变性 1mi n,60C退火和延伸1mi n,荧光探测；45个循环；于10C保存。TaqMan实时荧

42、光定量PCR程序设置Program for TaqMa n Real-time qua ntitative PCR ( Draw by Jia ng Sheng)每个标本均在三个反应体系中同时用三套引物进行扩增，每个标本重复三次。每次均同时设置3个标准曲线2.4统计分析根据临床资料，按照患者对化疗的反应性，将患者区分为化疗敏感组和化疗耐药组，使用成组t检验比较ERCC1在化疗敏感和耐药组间的表达差异，取 双侧，以a =0.05为检验水准。以ERCC1 mRNA表达量的中位值为界分为 ERCC1高表达组和低表达组， 对随访资料的生存分析采用 Kaplan-Meier法。使用log-rank te

43、st对数秩检验对生 存期进行统计检验。将可能影响卵巢癌患者化疗反应的因素进行Logistic多因素统计回归，将有关影响卵巢恶性肿瘤患者生存期的因素进行Cox比例风险回归模型分析。数据录入使用软件Microsoft Excel 2003,统计数据处理使用软件SPSS13.5 for wi ndows 进行。3.结果3.1病人一般资料所纳入的63例卵巢癌患者中位年龄49岁（27岁67岁）。根据国际妇产 科联盟（F刃印ation Internationale de Gyn colog皑 et dObst triqUe, FIGO） 2000 年 修订的临床分期标准来判断临床期别，结果：I期4例（6.

44、35%） ,11期6例（9.52%）， III 期 45 例（71.43%），IV 期 8 例（12.70%）。纳入卵巢癌患者的临床期别Clinical stage of the included ovarian cancer patients期别例数构成比%I期46.35%II期69.52%III期4571.43%IV期812.70%总计63100%另，按世界卫生组织（World Health Organization, WHO） 1973年制定的卵 巢组织学分类法进行组织学的分类，结果如下：浆液性囊腺癌16例（25.40%）,粘液性囊腺癌23例（36.51%），透明细胞癌7例（11.11%

45、），子宫内膜样癌9例 （14.30%），其它上皮性卵巢癌 8例（12.70%）。纳入卵巢癌患者的组织学类型Histology type of the in eluded ovaria n cancer patie nts组织学分类例数构成比%浆液性囊腺癌1625.40%粘液性囊腺癌2336.51%透明细胞癌711.11%子宫内膜样癌914.30%其它上皮性卵巢癌812.70%总计63100%另，按世界卫生组织（World Health Organization，WHO）1973年制定的卵巢组织学分类法进行组织学的分级，G1高度分化例（17.46%），G2中度分化20 例（31.75%），G3

46、低度分化 32 例（50.79%）。纳入卵巢癌患者的组织学分级Cell differe ntiati on of the in eluded ovaria n cancer patie nts组织学的分级例数构成比%高度分化1117.46%中度分化2031.75%低度分化3250.79%总计63100%3.2 TaqMan实时荧光定量RT-PCF检测mRNA使用构建好的TaqMan实时荧光定量 RT-PCR平台检测卵巢癌组织中的 ERCC1基因总量mRNA，缺失第8外显子的ERCC1变异剪接体的表达量，分 析效率在95%105%,且相关系数在0.901.00之间，每个10倍的浓度梯度之 间的C

47、t值相差在3.3左右，标准曲线的斜率在-3.0左右。加图3.3卵巢癌组织ERCC俵达与化疗敏感性的关系63例患者中有34例（53.57%）对化疗敏感，其中11人的ERCC1 mRNA 表达高于中位值，23人低于中位置；29例（46.43%）对化疗耐药，其中20人的 ERCC1 mRNA表达高于中位值，9人低于中位置。耐药组的ERCC1表达水平明 显高于敏感组。缺失第VIII外显子ERCC1变异剪接体的表达个体差异甚大，最 高值是最低值的70倍，占ERCC1 mRNA总量比例变化亦甚大，从1.8%到70.5%。 统计分析表明，缺失第VIII外显子变异剪接体的表达量与卵巢癌化疗反应性无 关。在总量

48、中去除变异剪接体的量后，ERCC1全长mRNA的表达水平与化疗敏 感性具有更低的P值。ERCC1 mRN相对表达量与化疗敏感性的关系The associati on of Chemotherapy resp onse and ERCC1 mRNA expressi onmRN俵达量（均数土 SD敏感24例耐药21例总 ERCC10.26 0.310.51 0.32P=0.043缺失第VIII外显子变异剪接体0.049 0.0320.09 0.05P=0.08全长ERCC10.21 0.110.45 0.26P=0.023使用Logistic回归模型（Logistic regression mo

49、de）对影响化疗反应的因素进行多因素统计分析，结果显示临床分期，病理学分级和组织学类型以及缺失第VIII外显子变异剪接体不是影响患者化疗反应的因素，ERCC1 mRNA表达水平（总量）是影响患者化疗反应的因素。卵巢癌患者化疗反应与临床病理的Logistic回归结果Logistic results of chemotherapy resp onse and cli ni cal pathology变量回 归系数标准误自由度P值OR95%可信区 间下限95%可信区 间上限临床分期0.9550.2610.615.23.678.72病理学分级1.230.7210.073.212.534.71组织学类型

50、2.350.1310.323.542.914.32变异剪接体1.950.4610.932.461.424.56ERCC1表达水 平1.430.0910.0342.761.263.753.4卵巢癌组织ERCC表达与患者生存期的关系随访时间为285月，平均随访37月，生存时间的计算方法为从接受治疗 之初到随访结束或者死亡之时。截尾 17例（36.96%）,死亡46例（73.04%）。 Log-rank test分析表明，ERCC1 mRNA表达量与患者的生存期相关（P=0.012）, 缺失第VIII外显子变异剪接体的表达量与患者的生存期不存在相关性（P=0.07），在总量中去除变异剪接体的量后，E

51、RCC1全长mRNA的表达水平与生存期具有 更低的P值。rawmlnUBIoSurvival FimicIIoos- - - A.B矗1 o QHAJAJnn E3UFunchonsh JT H k JlJIIIIIshStirVlVDiFOlClKMlSFL_n JI taw + 啊4 k*m *x*-EAlAJnG E3Udo*阳患者ERCCImRNA表达量高低组生存曲线比较Log-rank test 表明，ERCCImRNA表达的总量TT与全长FL与患者的生存期相关，缺失第VHI外显子的变异剪接体 AS与患者的生存期无关。Survival curve of ovaria n cancer

52、 patie nts使用Cox比例风险模型(Cox proportional hazard mode)对影响患者预后的因素进行多因素分析，结果显示临床分期，病理学分级和 ERCC1 mRNA (总 量)是影响患者预后的因素，而组织学类型和 ERCC1缺失第VIII外显子变异剪 接体不是影响患者预后的因素。临床病理与患者预后关系的Cox比例风险回归模型Cox regression results of survival time and clinical pathology变量名偏回归标PR上系数准误J直R值限限临床分期3.760.0326421.029.26.51I .31病理学分级4.261

53、.0421231.014.56.34I 0.33组织学类型7.860.010248.86.26.94.78变异剪接体5.620.063159.73.31.541.12ERCC1表达5.310.0731水平81.028.82.692.374讨论4.1真核生物中的变异剪接从1977年 Walter Gilbert提出可变剪接概念，1980年Baltimore在小鼠IgM 基因发现第一个可变剪接产生膜型、分泌型IgM，至2001年，用经典分子生物学实验的方法研究，一共仅发现了数百种有可变剪接的基因。并推测在高级真核细胞生物约5%的基因有可变剪接。在卵巢癌的发生发展中也伴随着一些基因的 变异剪接10。

54、据预测，人类基因组可能有约35,000个基因，果蝇约14,000个，而简单的 模式生物线虫约19,000个基因。生物的复杂性与其基因组基因数量似乎存在明 显差异。其原因在于蛋白质组、基因重排，RNA编辑，和变异剪接等机制可以从一个基因产生多种蛋白，从而使蛋白质组中蛋白质的数量超过基因组中基因的 数量。其中，从影响的基因数量和生物种类范围来看，可变剪接是扩大蛋白质多样性的最重要的机制真核细胞基因表达所转录出的前提 mRNA的剪接过程中，参加拼接的外显 子可以不按其在基因组的线性分布次序拼接，内含子也可以不被切除而保留，即一个外显子或内含子是否出现在成熟的mRNA中是可以选择的，这种剪接方式称为选择剪接/变异剪接(alternative splicing )。现已发现的选择剪接方式主要有 以下几种：1. 外显子选择方式可保留或部分保留外显子：外显子选择 (optio nal exo n)也 称外显子跳跃(exon skipping),是指在不同的剪接方式中，某一个外显子(或几个 外显子)可以在成熟的 mRNA中保留，也可以通过剪接过程被去掉。所以至少 有两种剪接方式，一个是外显子全部保留，而是删除了一个或几个外显子。本次 研究的ERCC1第8号外显子就属于此种情况，产生缺失 ERCC1第8外显子的机制是外显