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文档简介

1、基因探针 分子杂交技术,基因探针,基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列(dna或rna,分子杂交技术的分类,根据其检测对象不同，可分为,基本操作程序,southern杂交,检测样品dna的处理,电泳分离及变性处理,转移并固定到滤膜上,探针的制备及杂交,检测与分析,检测样品dna的处理,提取检测样品的基因组dna 用限制性内切酶对其进行酶切，至大小不同的dna片段,电泳分离及变性处理,琼脂糖凝胶电泳分离dna片段,变性处理 通常dna变性的方法：热变性、酸碱变性、化学试剂变性 在0.4m naoh碱性条件下变性,凝胶,0.4m naoh,转移并固定到滤

2、膜上,通过毛细管虹吸法，将凝胶上的dna转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。最后通过紫外线照射将dna固定在滤膜上,转移的方法,毛细管虹吸法、电转移法、真空转移法,探针的制备,一、探针的合成 pcr、化学合成等方法 二、探针的标记 同位素：3h、35s、32p等 非同位素：地高辛、生物素、荧光素等,地高辛： 可以与dctp连接成地高辛-dctp,原理： 地高辛 + 抗地高辛抗体 （带有荧光素或酶的标记,杂交,预杂交：将结合了dna分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精dna或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。 杂交：在一定的温度和溶液条件下，将标记的探

3、针与滤膜混合，如果滤膜上的dna分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸在滤膜上,洗膜：经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去,安装杂交管,杂交炉,检测与分析,1、放射自显影：适用于放射性同位素标记的探针 2、比色或化学发光检测：适于非同位素标记的探针 通过放射自显影或生化检测，就可判断滤膜上是否存在与探针同源的dna分子及其分子量,northern杂交,1、检测对象为rna。 2、与southern杂交不同的是：1）不需要限制性核酸酶切；2）变性方法不是碱变性，而是采用化学试剂变性法。 3、主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mrna的表达水平，或比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况,western杂交,1、基本原理和基本过程与southern 杂交基本相同 2、检测对象为蛋白质（或酶） 3、sds-page电泳分离

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