罗仙子抗动脉粥样硬化的作用及机制研究

1、罗仙子抗动脉粥样硬化的作用及机制研究前言动脉粥样硬化 (Atherosclerosis, AS)是心脑血管疾病发生的最直接原因之一 , 其发病机制主要涉及脂类代谢紊乱及脂质侵润、氧化损伤、炎症损伤等学说 , 但确切病因和发病机制迄今尚未完全阐明。随着研究不断深入, 发现 AS的发生与发展是机体对血管内皮损伤等产生的一系列慢性炎症的动态反应。AS的病理变化包括了组织细胞变性、坏死, 单核巨噬细胞 / 淋巴细胞渗出等经典炎症反应。血管内皮细胞是免疫系统的重要组成, 其生长、增殖及迁移直接影响免疫反应分布及定位的微环境。炎症免疫贯穿于 AS发生与发展的整个过程 , 因此 , 炎症免疫调控成为研发治疗

2、 AS药物的新方向之一。罗仙子原名家蝇蛆, 又称五谷虫 , 为传统中药材之一 ,载于本草纲目虫部第四十卷。具有清热化痰、健脾胃、消滞化积之功效, 临床也用于脓疱、疖及消化器官的细菌感染等的治疗。研究表明, 罗仙子分泌物在体外能够抑制人单核细胞炎症因子的表达释放 , 并诱导单核细胞分化为巨噬细胞；在治疗褥疮和皮肤移植患者的过程中 , 发现罗仙子提取物可增强机体的免疫力；另外 , 罗仙子对外伤、 烧伤及糖尿病引起的溃疡均具有良好的促愈合作用。这表明 , 罗仙子中可能富含与炎症免疫调控相关的活性物质。炎症免疫与 AS形成密切相关 , 因此 , 在前期的研究中 , 我们初步对罗仙子抗AS作用进行了探讨

3、。通过组织匀浆、高速离心等方法获得了罗仙子富含蛋白的提取物, 以球囊损伤联合高胆固醇饮食构建的大鼠动脉粥样硬化模型及apoE-/- 小鼠为实验对象 ,进行灌胃处理。结果表明 , 该提取物可降低 AS小鼠及大鼠的血脂及炎症因子水平,有效抑制 AS的发生发展；对细菌脂多糖 (Lipopolysaccharides,LPS)诱导的巨噬细胞炎症因子的释放及活化具有显著的抑制作用。但是 , 罗仙子富含蛋白的提取物成分复杂, 其抗 AS效应的确切物质基础及具体的炎症免疫调控的作用机制还不明确, 本文主要针对这两个问题进行进一步的深入探讨。旨在为从传统中药罗仙子中开发出一种有效治疗AS的新药提供理论基础。实

4、验方法：1. 罗仙子抗 AS活性部位的体外筛选与体内功效验证(1) 罗仙子富含蛋白提取物的分离制备人工饲养方式获取家蝇3 龄幼虫 , 采用冷热刺激法诱导富集活性成分； 幼虫经清洗、消毒处理后 , 进行高速组织匀浆、 过滤、超声破碎、低温高速离心、真空冷冻干燥、索氏脱脂, 获得罗仙子富含蛋白提取物(ProteinExtracts,PE)。利用葡聚糖过滤凝胶色谱法对PE进一步的分离 , 并按照分子量大小合并为三个组分。(2) 罗仙子抗 AS活性部位的体外筛选对获取的三个不同组分进行体外炎症免疫调控活性筛选 , 以 LPS诱导的巨噬细胞为筛选平台 , 检测不同组分对炎症因子 TNF与 MCP-1的表

5、达水平及对巨噬细胞活化的影响 , 据此筛选出最有效部位。(3) 采用小鼠 AS动物模型验证最有效部位的体内活性采用 LPS肌肉注射联合高胆固醇饮食方法 , 建立小鼠动脉粥样硬化模型 , 采用灌胃途径给药 8 周后 , 检测动物血清中 TC、TG、 LDL、HDL、TNF及 IL-1 水平 , 取模型动物的肝脏、心脏、胸主动脉进行 HE染色观察组织病理变化情况 , 验证该组分在动物体内抗动脉粥样硬化的作用效果。(4) 进一步明确最有效部位的组成成分采用 Tris-tricine-SDS-PAGE 垂直电泳技术 , 根据分子量大小进一步明确该最有效部位的组成成分。2. 罗仙子炎症调控机制研究设罗仙

6、子富含蛋白提取物、最有效部位和阴阳性对照组, 以 LPS诱导的巨噬细胞为实验对象 , 采用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察p65 核转移情况 ,Western Blotting 与 RT-PCR检测对 p65 蛋白表达的影响 , 探讨最有效部位对NF- B 信号通路的影响。3. 罗仙子免疫调控机制研究 (1) 罗仙子对巨噬细胞与内皮细胞相互作用的影响设罗仙子富含蛋白提取物、最有效部位和阴阳性对照组 , 从细胞和动物水平来观察罗仙子对巨噬细胞与内皮细胞相互作用的影响。 细胞水平： 采用佛波酯诱导人源巨噬细胞 THP-1分化为巨噬细胞 , 与 LPS进行不同时间的共孵育 (4h 和 24h)后 ,

7、 收集细胞 , 分为两组。一组与内皮细胞 ECV304进行混合培养 , 另一组采用 Transwell 小室进行分隔培养 ,24h 后, 采用流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况、细胞划痕实验及Transwell实验检测细胞迁移趋化情况, 探讨罗仙子对 LPS诱导的巨噬细胞对内皮细胞生长、 增殖及迁移的影响。 动物水平： 以 LPS肌肉注射联合高胆固醇饮食建立小鼠动脉粥样硬化模型, 采用组织免疫荧光技术观察心脏及胸主动脉斑块中巨噬细胞的侵润情况。(2) 罗仙子对 TNF诱导的内皮细胞生长、增殖及迁移的影响设罗仙子富含蛋白提取物、最有效部位和阴阳性对照组。以 TNF与内皮细胞进行共培养 , 流式细胞

8、术检测细胞周期和凋亡情况 , 细胞划痕实验检测细胞迁移情况 , 观察罗仙子对在 TNF诱导下的内皮细胞生长、增殖及迁移的影响。4. 统计学分析采用 SPSS13.0软件进行统计学分析 , 构建筛选平台和动物模型时 , 涉及两组之间数据的比较 , 采用独立样本 t 检验；对炎症因子水平、 血脂水平、细胞迁移率等多组数据间比较时 , 采用单向方差分析 , 方差齐性时 , 多重比较采用 LSD法, 方差不齐时 , 多重比较采用 Dunnett T3 法。 P<0.05表示有统计学意义。实验结果： 1. 罗仙子抗 AS活性部位的体外筛选及体内功效验证罗仙子富含蛋白提取物经葡聚糖凝胶过滤色谱分离,

9、 并依据分子量范围合并后获得3 个主要组分 , 分别命名为样品 1、样品 2 和样品 3；体外细胞筛选实验发现, 相对于样品1 和 2, 样品 3 能够更有效的降低 LPS诱导的巨噬细胞培养液上清中TNF与 MCP-1的水平 , 减少活化巨噬细胞的比例。动物体内抗AS功效实验结果显示 , 样品 3 能有效降低血清 TC、TG、 LDL、TNF及 IL-1a 水平 , 且使 HDL升高 , 并能改善小鼠AS模型心肌细胞结构、抑制动脉血管的粥样化病变。进一步的 Tris-tricine-SDS-PAGE垂直电泳结果显示 , 样品 3 的分子量范围主要集中在 4.1KD 左右。 2. 罗仙子对 NF

10、-B 信号通路的影响倒置荧光显微镜和激光共聚焦显微镜检测结果显示：p65 蛋白在各组细胞胞浆中均有不同程度的表达 , 但样品 3 处理组荧光强度减弱 , 与其他各组相比具有差异性(P<0.01),细胞核中 p65 蛋白的表达水平也明显降低(P<0.01)。Western Blotting和 RT-PCR检测结果也发现 , 样品 3 处理组 p65 的表达水平降低。由此推测 , 样品 3 可能通过阻断 NF-B 信号通路来抑制炎症反应。3. 罗仙子对内皮细胞增殖周期和凋亡的影响流式细胞术检测结果显示：内皮细胞与经 LPS诱导 4h 和 24h 的巨噬细胞进行共培养 , 经样品 3 处

11、理 24h 后 ,S期细胞的比例均出现降低； 其中 , 经 LPS诱导 4h 处理细胞组的内皮细胞S 期比例降低更加明显 (P<0.01)。与阴性对照组比较 , 样品 3 处理组内皮细胞凋亡比例降低 (P<0.01),其中 ,24h 处理细胞组比 4h 处理细胞组的凋亡细胞比例增加。4. 罗仙子对内皮细胞迁移的影响细胞划痕实验结果显示：内皮细胞与LPS诱导 4h 的巨噬细胞进行分隔共培养, 经样品 3 处理后 , 其迁移率受到明显抑制(P<0.01)；内皮细胞与 LPS诱导 24h 的巨噬细胞进行分隔共培养, 经样品 3处理后 , 处理组几乎未见迁移。 Transwell实验

12、也得到了同样的结果, 说明 4h 处理组巨噬细胞比24h 处理组巨噬细胞对内皮细胞的迁移影响更明显。动物实验结果显示 , 样品 3 能有效的抑制巨噬细胞穿过内皮细胞进入血管内膜及心肌细胞间隙 , 改善动脉粥样硬化发生发展过程中巨噬细胞对内皮细胞的影响。 5. 罗仙子对 TNF诱导的内皮细胞生长、增殖及迁移的影响对TNF诱导的内皮细胞生长的影响结果显示, 阴性对照组晚期凋亡细胞比例显著增加, 样品 3及罗仙子富含蛋白提取物处理组均能较好的减少凋亡细胞的比例；阴性对照组中S期细胞比例增加 , 且出现碎片峰及多倍体峰, 样品 3 及罗仙子富含蛋白提取物处理组 S 期细胞比例下降 , 其中样品 3 的效果更好。TNF诱导的内皮细胞形态发生明显改变, 细胞出现多个伪足状结构, 迁移率显著提高 , 样品 3 处理组细胞迁移受到抑制, 细胞迁移率明显降低。 结论：本论文采用组织匀浆、过滤、超声破碎、高速离心、冷冻干燥、索氏脱脂等方法, 成功制备了罗仙子富含蛋白提取物, 经葡聚糖过滤凝胶色谱分离后, 获得了 3 个主要的部位 , 分别命名为样品 1、样品 2 和样品 3。在