美洲大蠊抗肿瘤活性成分及其结肠定位片的研究

1、美洲大蠊抗肿瘤活性成分及其结肠定位片的研究美洲大蠊 Periplaneta americana(L.)为昆虫纲 (Insecta),蜚蠊目(Blattodea),蜚蠊科 (Blattaria)昆虫的干燥全体。具有活血化瘀、解毒消疳、利水消肿等功效 , 含有蛋白质、 氨基酸、肽类、糖类等多种有效成分 , 现代研究表明 , 在抗癌、提高免疫力、治疗心血管疾病、修复皮肤等方面具有显著的作用。本论文在文献及前期工作基础上 , 以美洲大蠊为研究对象 , 富集纯化其多肽类抗肿瘤活性成分 , 再根据多肽类成分在胃肠道中易被酸解、酶解而失去药效的性质 , 采用新技术、新工艺将其研制成pH 敏感型口服结肠定位片

2、 , 主要研究内容如下：1. 美洲大蠊抗肿瘤有效部位的制备工艺研究：采用指标成分含量检测结合体外肿瘤细胞抑制试验 , 确定了美洲大蠊有效部位的制备工艺条件为：取美洲大蠊药材粗粉 , 石油醚除脂后 , 用 10 倍量 90%的乙醇浸泡 48h, 以 3ml/min/kg 的速度进行渗漉 , 收集渗漉液 , 滤过 , 滤液在 50 -60 减压浓缩至 1： 1(ml ： g), 药液通过 HP20大孔树脂 , 用 2BV70%的乙醇进行洗脱 , 收集 70%乙醇洗脱液 , 并在 5060下减压浓缩至 1：2(ml ：g), 冷冻干燥即得多肽类冻干粉。2. 美洲大蠊冻干粉的初步质量标准研究：采用紫外

3、- 可见分光光度法对冻干粉中氨基酸、多肽含量进行测定； HPLC法对尿嘧啶、次黄嘌呤、肌酐含量进行测定；对冻干粉中氨基酸的种类和含量进行检测；Tricine-SDS-PAGE 凝胶电泳测定了冻干粉中多肽的分子量 , 初步建立了美洲大蠊多肽类冻干粉的质量标准。3. 美洲大蠊冻干粉的抗肿瘤作用及其机制的研究：在前期研究的基础上, 对其体内抗肿瘤活性、 荷瘤小鼠免疫功能及对 SMMC-7721细胞凋亡的影响进行了研究。结果表明：美洲大蠊冻干粉各剂量组能抑制荷 H22和 S180 瘤小鼠肿瘤生长 ,同时能提高荷瘤机体的免疫功能； 可明显诱导 SMMC-7721细胞凋亡 , 抑制其增殖 ,呈现出一定的量

4、效关系 , 其机制可能与下调Bcl-2 蛋白表达 , 上调 Bax 蛋白表达 ,降低 Bcl-2/Bax比值有关 , 初步揭示了美洲大蠊抗肿瘤的作用机制。4. 美洲大蠊冻干粉结肠定位片的制备研究： 根据美洲大蠊抗肿瘤活性多肽的性质 , 为避免多肽成分在胃肠道中易被酸解、酶解而失去药效 , 选择 pH敏感型包衣材料 Eudragit S100将冻干粉制成结肠定位片剂 , 有利于药物的吸收 , 发挥持久的药效。在制备合格素片的基础上 , 以肌酐的累积释放度为指标 , 确定具有结肠定位的包衣处方及包衣工艺参数 , 制备了美洲大蠊结肠定位片。三批样品药物的释放行为相似 , 达到结肠定位释放的目的 ,

5、对样品的释药曲线进行模型拟合 , 发现美洲大蠊冻干粉结肠定位片的体外释药行为符合威布尔模型。本论文对美洲大蠊抗肿瘤活性多肽进行初步分离 , 制备了美洲大蠊抗肿瘤活性部位；建立了冻干粉的初步质量标准；对其进行抗肿瘤机制的研究, 成功研制了 pH 依赖型口服结肠定位片 , 经体外释放度试验证明能准确定位到结肠 , 并满足药物溶出的要求 , 以期为临床提供高效、低毒、多样的用药选择。创新点： 1. 思路创新本论文从美洲大蠊抗肿瘤有效部位的提取与纯化, 冻干粉的制备 , 初步质量标准的建立 , 抗肿瘤作用及其机制的探讨, 结肠定位片的研制 ,形成“提取工艺化学成分药效作用成型工艺”的系统研究, 为深入

6、研究动物类中药新制剂提供新思路, 具有创新性。 2. 方法创新本论文采用化学指标与药效学实验指标相结合 , 对美洲大蠊抗肿瘤活性成分进行富集和纯化工艺；采用western-blot法、 Elisa法、 Hoechst33342/PI 双染法、 Annexin V-FITC/PI双染法等分析方法对美洲大蠊有效部位体内外抗肿瘤作用及机制进行研究。在制备结肠定位片中 , 采用肌酐溶出度结合f2 相似因子法对比不同处方、 工艺条件的累积释放曲线 , 对其体外释药相似性进行评价, 为动物类中药美洲大蠊结肠定位释放研究提供新方法, 具有创新性。 3. 应用创新本论文通过体内抗肿瘤活性、荷瘤小鼠免疫功能及对体外肿瘤细胞凋亡的影响初步揭示其抗肿瘤作用的机制 , 为其抗肿瘤药物的开发