鸡体抗传染性法氏囊病病毒天然免疫基因的miRNA调控机制

1、鸡体抗传染性法氏囊病病毒天然免疫基因的miRNA调控机制传染性法氏囊病 (InfectiousBursalDisease,IBD) 是由传染性法氏囊病病毒 (Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)引起的一种高度危害养鸡业的传染病。天然免疫 (innateimmunity) 是机体防御病原体感染的第一道防线, 在启动机体的获得性免疫应答中起着十分重要的作用。microRNA (miRNA)是一种 21-25nt 的小分子 RNA,是基因表达的调控子 , 本研究以 IBDV 为模式病毒 , 探讨了 miRNA在机体中调控干扰素、 p53 和模式识别受体抗 IB

2、DV 天然免疫的分子机制。 1 传染性法氏囊病病毒对鸡法氏囊组织中干扰素和 p53 转录的影响为了分析传染性法氏囊病病毒(IBDV) 感染鸡体内干扰素和p53转录水平差异变化 , 用 IBDV 弱毒 (B87) 和强毒 (QL/12) 分别感染 4 周龄 SPF鸡 , 每隔 12h 时 (12 84h) 取 3 只鸡的法氏囊组织混合匀浆, 用荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测其感染前后干扰素 (IFN) 和 p53 的 mRNA水平 , 同时分析法氏囊组织的病理变化和病毒载量。结果显示 :QL/12 组 ,IFN- 和 IFN- mRNA水平随着时间的增加逐渐升高 ,48h 达到峰值

3、, 随后降低 ;IFN- mRNA水平随着时间的增加逐渐升高 ,60h 达到峰值 , 随后逐渐降低 ;p53 mRNA含量迅速升高 ,60h 达到峰值 ( 比正常 SPF鸡高约90 倍), 随后降低。 B87 组 ,IFN- mRNA水平先降低后升高 (48h 达到最低值 ), 而IFN- mRNA水平变化不规则 ,72h 含量最高 ;IFN-ymRNA水平先逐渐升高后降低(72h 达到峰值 );p53 mRNA 含量变化较小 ,36h 含量最高 ( 比正常 SPF鸡高约 5倍 );QL/12 组诱导法氏囊组织产生的 IFN mRNA (IFN- 、 IFN- 和 IFN- mRNA)以及 p

4、53 mRNA 水平均显著高于 B87-IBDV 组。病理组织学检查可见 : 与正常对照组相比 ,QL/12 组法氏囊淋巴滤泡呈不同程度的损伤 ,B87 组法氏囊组织未见明显的组织病变。qRT-PCR检测 IBDV 病毒载量 ,QL/12 组法氏囊组织中病毒含量 48h 达到峰值 (8.4 106copies/mg), 而 B87组法氏囊组织中病毒含量72h 达到峰值 (6.6 104copies/mg) 。本研究为分析鸡体内IFN 和 p53 介导的抗 IBDV 天然免疫中的作用奠定了基础。 2 鸡 p53 抑制传染性法氏囊病病毒复制及gga-miR-2127 对其调控机制传染性法氏囊病 (

5、Infectious Bursal Disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)引起的一种高度危害养鸡业的传染病。肿瘤抑制蛋白 p53 能够抑制多种病毒的复制, 但对 IBDV复制的影响仍然不清楚。本研究以 IBDV 为模式病毒 , 采用体外感染模式 , 在 IBDV 感染的 DF-1 细胞中 ,p53 的表达水平和活性均显著升高。p53 过表达可以抑制IBDV 的复制 , 并激活鸡体抗病毒天然免疫基因(IPS-1 、IRF3、PKR、OAS、Mx)的表达水平上调 ;p53 抑制表达则得到相反的结果; 表明 p5

6、3可以激活鸡体的抗病毒天然免疫反应发挥抗IBDV 感染作用。用生物信息学方法和双荧光素酶报告系统分析发现gga-miR-2127 可以作用于 p53 的 3UTR;qRT-PCR和免疫印迹分析表明gga-miR-2127 可以使 p53 的蛋白水平表达降低 , 但mRNA水平没有变化 ;gga-miR-2127 过表达可以使鸡体的抗病毒天然免疫基因表达降低 ,IBDV 复制水平升高。本研究表明 :gga-miR-2127 可以作用于 p53 的 3UTR调控 p53 的表达来发挥抗 IBDV 感染的作用。 3 gga-miR-9* 靶向 IRF2 促进传染性法氏囊病病毒复制的分子机制为研究gg

7、a-miR-9* 对传染性法氏囊病病毒 (IBDV) 复制的影响 , 本研究用化学合成的方法合成gga-miR-9* 的模拟物 gga-miR-9*mimics, 转染 DF-1 细胞 ,24 h 后, 接种 IBDV, 48 h 后, 收集细胞培养上清液 , 测定 IBDV 的滴度 , 结果显示 ,gga-miR-9* mimics 能够促进 IBDV的复制。通过对病毒感染后的IFN 检测分析 , 发现 gga-miR-9* 可负调控干扰素 (IFN)的产生 ; 进一步用生物信息学方法和双荧光素酶报告系统分析验证,gga-miR-9*可靶向调控干扰素调控基因2(IRF2) 。用 wester

8、n blot和 qRT-PCR 分析 ,gga-miR-9* mimics 转染的 DF-1 细胞中 IRF2 蛋白和 mRNA水平均比正常DF-1 细胞显著降低 , 将细胞中的 IRF2 基因敲除 ,IBDV 复制滴度 (10625TCID50/0.1mL) 显著高于 miRNA对照组 (105 25TCID50/0.1mL),表明细胞gga-miR-9* 促进 IBDV复制的分子作用机理是在IRF2 基因转录后水平上抑制细胞天然免疫功能而发生的。4 传染性法氏囊病病毒感染对鸡细胞模式识别受体及抗病毒基因转录的影响为研究传染性法氏囊病病毒 (IBDV) 感染对鸡细胞模式识别受体 (PRRs)

9、及天然免疫抗病毒基因转录的影响 , 本实验分别用 IBDV 弱毒感染 DT40细胞和强毒感染SPF鸡, 以定量 PCR (qRT-PCR)检测感染细胞和法氏囊组织中PRRs(TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、MDA5和 LGP2)及天然免疫抗病毒基因 (IPS-1 、IRF3、PKR、OAS、Mx)的 mRNA转录变化。在 IBDV感染 DT40细胞的 2h 到 24h 内,chMDA5、chTLR3、chLGP2、 IRF3、 PKR、 OAS、Mx 的转录水平显著上升 , 分别为 324 、22、 61、 29、16、225 000 和 18 700倍。当用 siRNA 分别敲除 D

10、T40 细胞中 chMDA5、chTLR3 和 chLGP2 时,IPS-1 、IRF3、PKR、 OAS和 Mx在 IBDV感染后的 2h 到 24h 差异变化不显著。在IBDV感染 SPF鸡法氏囊组织细胞中 ,chMDA5和 chTLR3的表达显著降低 , 而 chLGP2表达没有显著差异 ,IRF3 、 PKR、OAS和 Mx的转录水平显著上升。TLR4和 TLR7在 IBDV的体外和体内感染试验中均未检测到, 而 IPS-1 在 IBDV的体外和体内感染试验中均变化不显著。本实验结果表明,chMDA5、chTLR3和chLGP2在识别 IBDV的感染中起着关键作用 ,IBDV 感染严重

11、抑制了鸡细胞模式识别受体 chMDA5和 chTLR3的转录 , 并且提示其抑制作用在体内与体外可能存在不同的分子机制。5 gga-miR-142-5p 调控 chMDA5抑制传染性法氏囊病病毒复制的机制传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病病毒引起的一种高度危害养鸡业的传染病。chMDA5在识别病原相关分子模式(PAMPs)及激活宿主的天然免疫应答中具有重要的作用,但 chMDA5识别 IBDV 的分子机制仍然不清楚。本研究以 IBDV 为模式病毒 , 采用体外感染模式 , 在 IBDV 感染的 DT40细胞中 ,chMDA5的表达水平显著升高。 chMDA5过表达可以抑制 IBDV 的复制 , 并激活IFN- promoter和 Mx promoter 活性 ,chMDA5抑制表达则得到相反的结果; 且chMDA5激活 IFN- promoter活性主要是通过 IRF7 通路 ; 表明 chMDA5可以激活鸡体的抗病毒天然免疫反应发挥抗IBDV 感染作用。用生物信息学方法和双荧光素酶报告系统分析发现gga-miR-142-5p 可以作用于 chMDA5的 3UTR; qRT-PCR和免疫印迹分析表明gga-miR-142-5p 可以使chMDA5的蛋白水平表达降低 , 但 mRNA水平没有变化 ;gga-miR-