基因工 程1.ppt

1、基因工程 Gene Engineering,教材用书： 基因工程原理 吴乃虎编著 科学出版社 参考书目： 基因工程导论 张惠展编著 华东理工大学出版社 植物基因工程 王关林编著 科学出版社,授课章节,第一章 概论基因与基因工程 第二章 基因的表达调控原理 第三章 重组DNA技术的基本方法 第四章 基因操作的主要技术原理 第五章 基因的克隆与分离 第六章 植物基因工程,第一章 概论基因与基因工程,第一节 引言 第二节 基因的现代概念 第三节 基因工程的诞生及其主要研究内容,第一节 引言,1 基因工程的概念 1.1狭义 Gene engineering又称为gene manipulation，是在

2、 分子生物学和分子遗传学等学科综合发展的基础上， 于上世纪70年代诞生的一门崭新的生物技术科学。 应用基因工程技术完全打破生物界物种的界限，在 体外对大分子DNA进行剪切、加工、重组后引入细 胞中表达，使其具有新的遗传特性，从而定向改造 生物。,第一节 引言,1 基因工程的概念 1.2 广义 指DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上下游技 术。上游技术指外源基因重组、克隆和表达载体构建；下游 技术则涉及含有重组外源基因的生物细胞的大规模培养以及 外源基因表达产物的分离、纯化过程。 指导 上游 下游 实现,第一节 引言,基因是实体：DNA或RNA（如烟草花叶病毒）； 基因是具有一定遗传效应的D

3、NA分子中特定的核苷酸序列； 基因是遗传信息传递和性状分化发育的依据； 基因是可分的，根据其编码产物的功能，可分为编码蛋白质基因、tRNA和rRNA，以及不转录却有特定功能的DNA区段（如启动子、操作子基因等）。,2 基因的概念 是一个含有特定遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。,3 基因学说的创立 孟德尔于1857-1864根据豌豆为材料进行杂交实验提出遗传因子(hereditary factor)概念并 推导了遗传因子分配定律；,Definition 1860s1900s: Gene as a discrete unit of heredity 基因是一个互不相连的遗传单位,丹

4、麦生物学家W. Jonsannse于 1909根据希腊语“给予生命”之意，创造了“gene”；,美国著名遗传学家摩尔根以果蝇为材料，提出遗传性状的连 锁规律。,白眼wy 红眼WW F1红眼Ww Wy 自交 1WW 1Wy 1wy 1wW,Definition 1910s: Gene as a distinct locus 基因是一个清晰的位点,第一节 引言,4 基因与多肽链 1944年G.M.Beadle研究红色面包霉(Neurospora crassa)时，提出一个基因一个酶：即生物体内发生的每一步代谢反应都是有一种特殊的酶控制的，而这种酶又是某一基因的合成产物。 后来，在研究血红细胞蛋白中

5、发现蛋白质可由不同肽链组成，而突变只影响一条肽链，因而提出一个基因一条多肽。,第一节 引言,5 基因与DNA分子 首先用肺炎双球菌实验证明基因的化学本质DNA分子的是美国著名微生物学家O.T. Avery于1944年发表。,实验证明遗传物质是DNA而非蛋白质。,第一节 引言,1952美国冷泉港喀内基遗传学实验室的A.D.Hershey用32P和35S分别标记噬菌体外壳蛋白质与DNA，感染大肠杆菌，证明了Avery的结论。,第一节 引言,1953 J. Watson 和 F. Crick DNA揭开双螺旋结构，奠定了现代分子生物学基础。 A. Gierer和G. Schramm在研究TMV时发现

6、RNA也能传递遗传信息。,Definition 1950s: Gene as a physical molecule 基因是物质性的分子,第一节 引言,6 基因与DNA的多核苷酸区段 1995年Sbezner运用T4噬菌体的 A B 一群紧密连锁的突变群互补实 验，提出顺反子（cirton）。 E coli溶原 顺反子一般可与基因通用，一 个基因是由一群突变单位和重组单 A突变 位组成的线性结构，因此顺反子概 不溶原 念表明：基因不是最小单位，它仍 + B突变 是可分的；并非所有DNA序列都是 不溶原 基因，只有某一特定的多核苷酸区 段才是基因编码区。 E coli溶原,第一节 引言,7 基因

7、的碱基顺序与蛋白质的氨基酸顺序 1958F. Crick综合分析了关于遗传信息流向的各种资料，提出中心法则(central dogma),第一节 引言,基于1971年H. M. Temin和D. Baltimore发现一些RNA肿瘤病毒： 病毒RNA分子 DNA RNA Protein,DNA,仅为理论,1961年F. Crick和S. Brenner成功破译三联体密码子(codon)。,Definition 1960s: Gene as transcribed code 基因为转录本编码,Definition 1970s1980s: Gene as open reading frame (O

8、RF)sequence pattern 基因是开放阅读框概念,Definition 1990s2000s: Annotated genomic entity, (current view, pre-ENCODE) 基因组注释的实体,DNA元件百科全书计划（Encyclopedia of Elements Project)对人类基因组1%区域内的功能元件进行分析，于2007年6月在Nature和Genome Research上发表。,人类基因组被普遍转录,每个蛋白编码位点平均具有5.4个转录本，其中只有1.7个转录本有可能编码蛋白,经典的基因的概念（基因是基因组上不相互关联的元件），已经被ENC

9、ODE动摇。 ENCODE项目目的是详尽分析存在在人类基因组上的功能元件，这项计划是人类基因组分析的里程碑。目前已经完成了人类基因组1%序列的详尽分析。人类基因组测序发现注释的人类编码蛋白基因的数目令人惊讶的少（根据最新的估计是21，000个），ENCODE计划发现了RNA转录本的数目和复杂的RNA转录。从这个角度来讲，ENCODE计划对“什么是一个基因”概念的理解的促进作用，高于人类基因组计划所促进的。存在于以蛋白为中心的基因概念和基因组的普遍转录现象之间的差异，促进我们重新考虑什么是一个基因。,A current computational metaphor: Genes as “subr

10、outines”in the genomic operating system 基因是基因组操作系统中的子程序。,A gene is a union of genomic sequences encoding a coherent set of potentially overlapping functional products.,基因是一个基因组序列的集合，这个集合编码一套连续的重叠的功能产物。,第一节 引言,8 基因的结构 典型的蛋白质编码基因的结构示意图,基因,基因,启动子,启动子,转录区,转录区,终止子,终止子,转录,转录,RNA起点,RBS ATG TAA 转录终止位点,5UTR

11、3UTR,5UTR 3UTR,RNA起点,ATG 初级RNA转录本 TAA 多聚腺苷酸化位点,原核 真核,第一节 引言,单拷贝基因：编码多肽，通常每单倍体基因组仅1-2拷贝； 多拷贝基因：如tRNA、rRNA及组蛋白基因； 基因家族(multigene families)：编码产物具有类似的结构和功能，可能有同一基因突变而来。,第二节 基因的现代概念,1 移动基因(movable gene) 又称为转位因子(transpoable elements)、跳跃基因(jumping genes) 分为：插入序列(insertion sequence, IS), 2000bp 噬菌体Mu和D108,第

12、二节 基因的现代概念,IS因子：是在细菌中首先发现的最 简单的一类转位因子，其 末端均具有一段反向重复 序列（IR）,IR,IS因子的形体图,第二节 基因的现代概念,转座子：由几个基因组成的特定的DNA片段，常带有抗生素抗性 基因，所以易于鉴定，分为复合系和Tn3系。 A 反向重复,B 同向重复,侧翼IS因子取向不同的两种复合转位子,中间分离区,IR序列：38bp -Lac：B-内酰氨酶基因（APr） TnpA：编码1015个氨基酸的转位酶 TnpR：编码185个氨基酸蛋白质（抑制 TnpA基因的合成活性；促进中间分 离区发生位点特异切割） Tn3系转位子的形体图,IR TnpA TnpR -

13、Lac IR,第二节 基因的现代概念,2 断裂基因(split gene),第二节 基因的现代概念,3 假基因(psuodogene) 1977年G.Jacq等首次提出，指一种核苷酸序列与相对应的功能基因基本相同，但不能合成出功能蛋白的失活基因。如人-珠蛋白及-珠蛋白基因簇，金属硫蛋白。,第二节 基因的现代概念,4 重复序列及重复基因(repeated gene) 不重复的唯一序列（仅1拷贝）：约70%，1kb左右； 低度重复序列（拷贝数10）：各序列基因产物氨基酸稍异； 中度重复序列（拷贝数10-几百）：组蛋白、rRNA、tRNA基因 高度重复序列（拷贝数几百-几万）：卫星DNA的简单重复序

14、列， 高丰度SINE(short interpersed elements，短散在序 列)的Alu序列包括与染色体结构特征有关的序列，如着丝粒、端粒和染色钮； A：端粒 B：着丝粒 C：染色钮 染色体中重复序列基元进行荧光原位杂交(FISH)定位。,第二节 基因的现代概念,1977年英国人F. Sanger)在测定 X174噬菌体DNA序列时发现，共5387个核苷酸，编码10个蛋白质。重叠类型有：一个基因完全在另一个基因中；两个基因末端的密码子重叠。 此外，C. Shaw和J. E. Walker还发现了三重叠基因。重叠基因主要在细菌、噬菌体、病毒等一些低等生物中。一些真核生物还发现了另一类重

15、叠基因： 一个基因存在与另一个基因的intron，如果蝇的蛹角质膜蛋白基因；以基因相反链编码的嵌套基因。,5 重叠基因(overlapping gene或嵌套nested),第三节 基因工程的诞生及主要研究内容,1 基因工程的诞生 核酸限制性内切酶：1972年H. Y. Boyer发现EcoRI位点GAATTC； DNA连接酶：1970年H. G. Khorana发现T4ligase; 基因克隆载体：如pBR322, pUC13等； 外源DNA分子导入细菌细胞：1972年S. Cohen采用CaCl2法将质粒导入大肠杆菌； DNA体外重组：P.Berg博士获1980年诺贝尔化学奖,猴病毒SV40的DNA 噬菌体 EcoRI Ligase 重组DNA分子,注：核心技术,第三节 基因工程的诞生及主要研究内容,基因克隆实验：1973年，Stanford大学的S. Cohen,Tcr,EcoRI,ligase,重组子,Tcr,Kanr,CaCl2转化大肠杆菌,Kan、Tc 筛选,第三节 基因工程的诞生及主要研究内容,2 基因工程的 主要研究内容 上游 下游,3 基因工程的应用与发展 有关基因结构与功能研究；,基因组核苷酸序列测定：噬菌体、叶绿体（烟草、水稻、地钱）、水稻、拟南芥、人类等；,转基因农作物； 转基因微生物； 转基因动物； 基因诊断与治疗。,小结,1 基因工程 指导