生物样品的预处理.ppt

1、生物样品的预处理,江南大学医药学院,初级分离阶段Primary separation,Primary separation的任务 分离细胞和培养液 破碎细胞释放产物 溶解包含体 复原蛋白质 浓缩产物 去除大部分杂质,生物样品的预处理,不同来源样品分离的预处理 植物组织提取物的制备 动物组织提取物的制备 细菌中重组蛋白的提取制备 细胞的破碎与分离 常见的方法 细胞破碎技术的发展方向,1 不同来源样品分离的预处理,样品来源：植物、动物、微生物，例如：植物或动物细胞培养液、微生物发酵液、动物血液、乳液和动植物组织提取液等。 生物样品中往往含有大量有机物、无机物及各种微量元素等，因此对目标组分进行初步

2、富集和分离，对干扰组分进行初步去除等工作都属于预处理,生物样品特征,目标产物浓度普遍较低，悬浮液大部分是“水”，组分复杂，是含有细胞、细胞碎片、蛋白质、核酸、脂类、糖类、无机盐类等多种物质的混合物； 分离过程很容易发生失活现象，pH、离子强度、温度等变化常常造成产物的失活； 性质不稳定，易随时间变化，如受空气氧化，微生物污染，蛋白水解作用等,分离过程注意点,迅速加工，缩短停留时间 控制好操作温度和pH 减少和避免与空气接触受污染的机会 总体设计好各组分的分离顺序,不同来源样品分离的预处理,1.1 植物组织中活性物质的提取 1.1.1 酶的提取 植物组织中所存在的酚类化合物使植物中提取酶的过程变

3、得复杂。 植物组织被破坏时，酶和酚类处混合接触状态，很易发生反应。产物苯醌和单宁酸类会继续和酶蛋白反应, 使目的酶失去活性。为此去除酚类化合物或避免反应是必须进行的步骤,酚类化合物与蛋白质的结合方式,可逆结合 酚类化合物的两个羟基与蛋白质分子形成氢键，例如肽键的CO端和NH端 不可逆结合 酚类化合物的两个相邻羟基被氧化为邻苯醌之后，通过共价键与蛋白质分子中的自由氨基以及巯基结合 引起蛋白质活性基团集合，引起聚集、交叉结合和沉淀（酶促褐变作用,预处理需要注意,温度尽可能低 提取液的量要保证“充分浸入” 加入足量酚类吸附剂 加入足量氧化酶抑制剂 搅拌转速要恰当 pH要控制在合适范围，一般5.57,

4、酚类吸附剂的种类,天然和合成的聚合物 清蛋白 尼龙粉 聚乙烯吡咯烷酮-可溶的（PVP） 通过-CO-N=与酚羟基形成氢键 聚乙烯聚吡咯烷酮-不溶的（PVPP） 聚乙烯和聚丙烯树脂，如离子交换树脂XAD-2、-4和-7 聚苯乙烯的离子交换树脂，包括阴离子交换树脂（Bio-Rad AG1-X8,AG2-X8和Dowex-1）和阳离子交换树脂（Dowex-50） 表面疏水，易吸附带疏水基团的化合物,酚氧化酶抑制剂 抗氧化剂：2-巯基乙醇，二硫苏糖醇(DTT)，二硫赤藓糖醇(DTE) ，抗坏血酸盐 前三种既是多酚氧化酶的抑制者又是醌的清除剂 抗坏血酸盐能阻止醌重新还原成酚， 在低浓度的醌存在下就很易被

5、消耗，因此须在相对较高的浓度条件下使用（50mmol/L,1.1.2 RNA的提取,从植物组织中提取RNA是进行植物分子生物学方面研究的必要前提。 Northern杂交分析、纯化mRNA以用于体外翻译或建立cDNA文库、RT-PCR及差示分析等过程中需要高质量的RNA 能否有效地去除多糖、酚类化合物、萜类化合物RNase和干扰RNA提取的其它代谢产物是提取高质量植物RNA成败的关键。 酚类化合物与RNA不可逆结合 导致RNA活性丧失、用苯酚或氯仿抽提时RNA丢失、形成不溶性复合物 多糖会形成难溶的胶状物，与RNA共沉淀 萜类化合物和RNase会造成RNA的化学降解和酶解,酚类化合物的干扰及对策

6、,还原剂法 2-巯基乙醇(ME) 、二硫苏糖醇（DTT）或Cys 来防止酚类物质被氧化，硼氢化钠（NaBH4）是可还原醌的还原剂 螯合剂法 PVP和PVPP中的-CON基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随着多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强 Tris-硼酸法 硼酸可与酚类靠氢键形成复合物，抑制了酚类物质的氧化及其与RNA的结合,牛血清白蛋白（BSA）法 原花色素类物质与BSA间可产生类似于抗原抗体间的相互作用，形成可溶性的或不溶性的复合物，减小了原花色素类物质与RNA结合的机会 丙酮法 用-70的丙酮抽提冷冻研磨后的植物材料,可有效从云杉、松树、山毛榉等富含酚类化合物的植物材料中分离

7、到高质量的RNA 通过Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以将未被氧化的酚类化合物去除,多糖的干扰及对策,植物组织往往富含多糖，而多糖的许多理化性质与RNA很相似，较难将它们分开。含多糖的RNA沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液，对RNA提取造成较大的干扰。 对策： SDS-盐酸胍处理； 高浓度Na+或K+离子下，苯酚、氯仿抽提； 低浓度乙醇沉淀多糖； 醋酸钾沉淀多糖,蛋白杂质的影响及对策,蛋白质是污染RNA样品的又一个重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦属于蛋白质，因而要获得完整的、高质量的RNA就必须有效地去除蛋白杂质。 常规方法： 冷冻条件下研磨植物材料以抑制RNase等的活性； 提

8、取缓冲液中含有蛋白质变性剂，如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等，这样在匀浆时可以使蛋白质变性，凝聚； 利用蛋白酶K来降解蛋白杂质，进一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白质,次级代谢产物的影响及对策,从植物组织中提取高质量RNA的另一个难点是许多高等植物组织尤其是成熟组织能产生某些水溶性的次级代谢产物，这些次级代谢产物很容易与RNA结合并与RNA共同被抽提出来而阻碍具有生物活性的RNA的分离。 由于不能确定次级代谢产物具体是什么物质，目前没有什么特殊的方法来解决这个问题,1.1.3 多糖的提取,多糖广泛存在于植物、微生物（细菌和真菌）和海藻中，来源很广。 我国是中药的起源之地，而

9、糖类是中药材中普遍存在的成分，在对各种中药材的化学成分研究的过程中，人们都少不了对其中多糖的关注。 动植物中或微生物胞内多糖的释放步骤： 去除表面脂质，常用醇或醚回流脱脂； 脱脂残渣用溶液提取(即冷水，热水，0.11.0 mol/L NaOH，1%醋酸或1%苯酚等)； 提取液除杂：对于无机盐及低分子量的有机物质可用透析法、离子交换树脂或凝胶过滤法除去；对于大分子杂质可用酶消化(如蛋白酶、木质素酶)，乙醇或丙酮等溶剂沉淀法或金属络合物法,蛋白杂质的影响及对策,多糖提取液中除去蛋白质是一个很重要的步骤，常用的方法有 Sevag法 氯仿：戊醇（或正丁醇）：多糖水溶液=5：1：6 较温和 三氟三氯乙烷

10、法 多糖水溶液：三氟三氯乙烷=1：1 效率高、不易大量应用 三氯乙酸法 多糖水溶液中滴加3%三氯乙酸 较剧烈，不适合含呋喃糖残基的多糖 酶解法 前三种方法不适合糖肽的分离 三氯醋酸法和Sevag法的脱蛋白效果相近，并且蛋白酶法与Sevag法相结合除蛋白的效果较好,1.2 动物组织预处理注意事项,匀浆化前的预处理(冷冻) 提取物缓冲液的选择(中性) 蛋白酶抑制剂的添加 保护剂的添加(-巯基乙醇、EDTA、辅酶等) 提取液的澄清( 高速离心、沉淀、吸附等,1.3 微生物物质的提取制备,各种发酵产品，由于菌种不同和发酵液特性不同，其预处理方法的选择也有所不同。 大多数发酵产物存在于发酵液中，也有少数

11、产物存在于菌体中，或发酵液和菌体中都含有。 对于胞外产物，经预处理应尽可能使目的产物转移到液相，然后经固液分离除去固相； 对于胞内产物，则应首先收集菌体或细胞，经细胞破碎后，目的产物进入液相，随后再将细胞碎片分离,大肠杆菌重组蛋白的提取制备,多拷贝质粒上强启动子过量表达重组蛋白质使整个细胞的蛋白质表达水平提高,但大多情形下会导致诸如包含体的不溶性蛋白聚集的形成,重组菌E. coli M15(pQE32-AGN)外源基因的诱导表达(A未诱导，B诱导,包含体,包含体（inclusion bodies）是无定形的蛋白质的聚集，不被任何膜所包围。细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密，低速离心就可以沉淀。

12、包含体难溶于水中，在变性剂溶液（如盐酸胍、脲）中才能溶解。在这些溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即所有的氢键、疏水键全被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏。因此当除去变性剂时，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质的复性。 包含体主要由蛋白质构成，其中大多是基因表达产物。这些基因表达产物没有生物活性。为此，欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包含体后，溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。所以，包含体的出现增加了生化工程师生物分离设计的难度,重组蛋白的提取步骤,大肠杆菌的酶解 采用溶菌酶或超声破碎方法来破壁 包含体的清洗 用溶剂清洗包含体

13、能进一步除去杂蛋白 从包含体中溶解重组蛋白（变性） 选择和优化溶解液（一般为尿素和盐酸胍），使包含体中重组蛋白溶解 重组蛋白的复性 稀释法、透析法、层析法、分子伴侣等,2 细胞的破碎与分离,细胞的破碎： 用一定方法（机械法、物理法、化学法、酶法等）打开细胞壁或膜，使细胞内含物有效地释放出来。 提取： 目的物从胞内转移到外界溶液中。 细胞 提取剂 提取液（液体目的物） 沉淀洗涤提取物（固体目的物,破碎,匀浆,离心,2.1 细胞的破碎方法,2.1.1 机械法 原理：机械运动产生剪切力的作用破细胞 组织捣碎法 适合：硬度较大的动、植物组织,高速匀浆法 特点 破碎程度高，而其机械剪切力对生物大分子的破

14、坏较少，处理量大。 原理 利用高压使细胞悬浮液通过针性阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破裂。 适用 较柔软、易分散的组织细胞,高速匀浆机,高速匀浆法为大规模细胞破碎的常用方法，设备由高压泵和匀浆阀组成,研磨法与珠磨法 研磨法(实验室规模) 由陶瓷的研钵和研杆组成，加入少量研磨剂（如精制石英砂、玻璃粉、硅藻土） 珠磨法(工业规模) 进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英沙、氧化铝等研磨剂（直径1 mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎,释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。 适用：微生物（细菌）与植物

15、细胞,珠磨机,卧式珠磨机,立式珠磨机,挤压法,微生物细胞在高压下通过一个狭窄的孔道高速冲出，因突然减压而引起一种空穴效应，使细胞破碎。 适用：细菌（革兰氏阴性菌,2.1.2 物理法,超声波破碎 频率为20kHz以上的波，超过人耳可听范围。其对细胞的破碎与空穴的形成有关。 空穴作用：在超声波作用下，使气泡形成、胀大和破碎的现象。 一般样品浓度、声强、频率、介质的离子强度、pH、处理时间都对破碎有影响。 微生物细胞条件: 样品浓度50100mg/ml，输出功率100200W，破碎时间35分钟，间歇操作，样品量40ml，冰浴操作,超声破碎仪,渗透压冲击法 高渗突然低渗，反复后可造成细胞破碎，促使内含

16、物释放。 适用：处理胞壁较脆弱的微生物。 反复冻融法 将材料深冷（-15-20），形成水晶，破坏胞膜疏水键，增加亲水性，反复可破细胞。 适用：动物材料,急热骤冷法 将材料投入沸水，维持8590数分钟，冰浴中急速冷却，使胞壁结构破坏。 适用：细菌及病毒等中对热不太敏感的物质提取 干燥法,2.1.3 化学法,溶剂处理法 丙酮、氯仿、甲苯等脂溶性溶剂可溶解胞膜上脂质化合物，使细胞结构破坏。 表面活性剂法 添加如十二烷基磺酸钠、去氧胆酸钠等，通过破坏细胞膜而破碎细胞，释放目的物。 此法常需与其它方法结合应用,2.1.4 酶解法,自溶法 将欲破碎细胞在一定条件（pH、T）下保温一定时间，通过细胞本身存在

17、的酶系的作用，将细胞破坏，使胞内物质释放。 外加酶法 利用各种水解酶专一性地将细胞壁分解，使内含物释放出来。 细菌：加溶菌酶（结合反复冻融或加EDTA） 酵母：采用-葡聚糖酶 霉菌：添加几丁质酶 植物材料：加纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等,2.2 选择依据,总原则：最大提取、不易变性、减少干扰 具体须从材料特性、目的物特性综合考虑 材料细胞的特性 动物细胞易破碎，只需用温和方法 植物细胞较难破碎，须用中等或强度大的方法 微生物细胞较复杂，一般用较强的方法,目的物的特性 细胞中的位置 游离状：只需温和破碎，除去不溶部分。 结合状：可能结合在膜或细胞器内，需先收集膜或细胞器，再破碎 敏感性 温度、

18、pH、氧、剪切力、杂酶等影响 处理量 有些处理量大，如组织捣碎机、匀浆器等。 有些处理量少，如超声波破碎等,2.3 提取剂,2.3.1 组成 要求：目的物溶于其中，保活性，减杂质。 考虑因素如下： （1）离子强度 影响物质溶解度的主要因素，适当的低离子强度溶液（0.050.2mol/L）除增加溶解度，还对活性有稳定作用,2）pH 影响目的物的溶解度及稳定性。 一般控制在pI附近的稳定性范围内。 （3）添加剂 抑制剂（主要水解酶抑制剂），如提取核酸时，添加核酸酶抑制剂防目的物被分解。 保护剂（稳定性），如对含巯基的酶添加谷胱甘肽等巯基保护剂,2.3.2 用量,目标 收率（80%以上）且目的物浓度大 动物、微生物加1.53体积的提取剂； 植物加入0.51体积的提取剂,2.4 提取液的澄清,动物、微生物提取液往往较混浊，需澄清 沉降速度：V=d2(-)2/18 显然：加大或d或减小都可增加V 方法： 粒子聚结（增大d） 25% (NH4)2SO4处理 酸化