IVF实验室的基本操作

1、ivf实验室的基本操作,实验室操作原则,辅助生殖技术基本操作,培养液的准备,培养液的基本组分 无机盐离子-维持ph和渗透压 碳水化合物-能量来源 蛋白质来源 抗生素 矿物油 有利于维持培养液温度、ph值和渗透压稳定 防护屏障，减少污染 吸收脂溶性毒素 防止液体蒸发,培养液的准备 取卵前一日下午进行,原则：高效、方便、安全、经济 四孔培养皿卵 处理精液所需培养液 微滴培养受精卵、胚胎 胚胎移植液,37 ， 5% 或 6%co2培箱内 平衡过夜,卵母细胞的获取,注射hcg后36-38小时取卵 阴道超声探头引导下经阴道穿刺抽吸卵泡 核对姓名 解剖显微镜下辨认卵冠丘复合物occc 37, 56%co2

2、 培养 操作迅速，避光,精液处理,正常精液：同iui 极度少精：增加离心力 死精症：低渗肿胀实验 附睾穿刺精子： 睾丸穿刺或活检精子： 1ml注射器针头挑碎组织，离心悬液 附睾、睾丸精子的冷冻,常规受精,适应症：精液正常， 轻度少、弱精症 受精率：6580（mii卵） 受精时间：长受精、短受精,卵母细胞浆内单精子显微注射,适应症：严重少弱精、梗阻性无精、畸精症、既往ivf常规受精失败史、某些不明原因不孕等 时间：取卵后2小时 剥卵：利用透明质酸酶（80miu/ml)和机械法剥除颗粒细胞,卵母细胞浆内单精子显微注射,卵母细胞成熟度的评价,gv,mi,mii,卵母细胞浆内单精子显微注射,操作滴的准

3、备：7pvp 加精 装针 显微注射 受精率：70,受精方式的选择,icsi的安全性？ 逃避了自然选择过程 垂直传递遗传缺陷 操作过程对配子的损伤 严格掌握icsi适应症,非男性因素不孕icsi治疗结局,非男性因素不孕症，icsi未显现出优势,检查受精,时间：受精后1518小时 机械法除去颗粒细胞及放射冠 正常受精：两个原核，两个极体,合子形态评价,原核的大小、位置及方向 核仁前体的数目、大小、分布 胞浆的外观 早期卵裂情况,异常受精1pn,发生率 15 卵裂率 74% 染色体二倍体率 5 囊胚形成率 29% (noyes 2008) 机制： 雌雄原核发育不同步 雌雄原核融合 孤雌来源 icsi

4、多见,异常受精多pn,发生率：ivf 5-8% icsi 1% 发生机制： 2精子进入 第2极体滞留 双倍体卵母细胞,未见原核未受精,可能机制 卵母细胞未成熟 卵母细胞染色体异常 卵裂率 10% 染色体二倍体率 3% 优胚率低 (12/38) 囊胚形成 (0/12) (noyes 2008,受精失败,受精率20% 受精率低下 所有成熟卵均未受精 受精失败 常规受精周期 失败率 10 精子功能障碍 卵母细胞成熟障碍 补打icsi? icsi周期 失败率 23 严重精子畸形 卵母细胞激活 钙离子载体？机械激活,胚胎培养,胚胎质量评价,胚胎评价标准 细胞数 碎片:无碎片 碎片50% 卵裂球均匀程度,

5、囊胚的评分体系,4aa,囊胚腔的大小,内细胞团细胞分级,滋养层分级,三位评分法,1:不到整个胚胎的一半 2 :超过了胚胎体积的一半 3 :完全占据整个胚胎 4:扩张囊胚 5:孵化囊胚 6:孵化后囊胚,a包裹紧密，大量细胞 b结构松散，少量细胞 c极少量细胞,a许多细胞紧密结合 b少量细胞，结构松散 c极少量细胞,2aa,5aa,4ba,4cc,胚胎移植操作,选择需要移植的胚胎,移入移植滴内 35岁以下，首次移植的病人移植2枚胚胎 35岁以上，或非首次移植的病人移植3枚胚胎 确认核对患者姓名 d3 or d5 移植,移植液,移植液,移植液和胚胎,气,20l,气,胚胎移植操作,胚胎冷冻,意义：提高

6、累计妊娠率，避免多胎，减少卵巢过度刺激风险 温度的急剧变化形成冰晶 机械性损伤 溶质性损伤 渗透压损伤 核心：避免冰晶形成 冷冻方法：慢冻速融法 玻璃化冷冻法 冷冻保护剂 渗透性保护剂：eg pron 甘油 非渗透性保护剂：蔗糖 大分子物质,胚胎的冷冻:慢速冷冻,1.5m丙二醇0.1m蔗糖,慢冻速融法,冷冻程序 207 3/min -7 人工植冰 -730 0.3/min -30120 30/min,胚胎复苏,1,2,3,4,0.5m丙二醇 0.2m蔗糖 5min,0.2m蔗糖 5min,pbs 5min,1.0m丙二醇 0.2m蔗糖 5min,预防冰晶的再形成 复苏程序： 室温 40s 30水浴 1min,胚胎冻融损伤,复苏胚胎评价：50%卵裂球完整 存活 复苏率90% 无损伤胚胎着床率高 部分损伤胚胎着床能力下降,玻璃化冷冻,原理 条件：高浓度冷冻保护剂 极快的降温速度 载体：开放式 密闭式 适应症：卵母细胞 囊胚 优点：复苏率高,其他技