Hsp163蛋白纯化分析中文

1、暑期实验生化部分实验目的1了解基本的分离提纯蛋白质的原理方法和技术。HSP 16.3。了解其分子伴侣活性及寡聚结构。2提取分子和微生物实验中自制重组细菌产生的蛋白质3测定HSP 16.3的分子活性，4 .提纯和检测Tag酶蛋白。1. HSP 16.3HSP 16.3是来自结核杆菌 正常条件下仅有少量表达，当 为细胞内的主要蛋白。另外，背景介绍M.tuberculosis的小分子量热休克蛋白 （430bp）。HSP 16.3在M.tuberculosis从对数期到稳定期的转变中显著表达，并成HSP 16.3还是 M.tuberculosis很强的抗原性蛋白，是 T, B细胞发生免疫反应的重要靶点

2、。体外实验表明，HSP 16.3具有分子伴侣的活性，HSP 16.3在39.5 C时可以抑制柠檬酸合成酶的热聚集，且其活性不依赖于ATP,但不能保护柠檬酸合成酶的活性，说明HSP 16.3是与部分去折叠的柠檬酸合成酶发生作用，体内蛋白的再折叠可能还需要其它蛋白参与。通过凝胶层析还可分离出HSP 16.3与柠檬酸合成酶形成的复合物，并在随后的SDS-PAG冲得到证实。HSP 16.3可能是通过暴露疏水表面来行使其分子伴侣活性 的。实验表明：HSP 16.3在较温和温度和低浓度变性剂诱导下，如极低浓度的盐酸胍（0.05M,尿素（0.3 M ）或30C的温度处理时，会暴露疏水表面使得其分子伴侣活力迅

3、速上升。HSP 16.3-crystalli ne 白家族典型的 shock P rote in,是144个氨基酸组成的，分子量为16277Da，其序列分析结果表明它属于相关的小分子量热休克蛋白（sHSP）家族的一员，具有 -crystalline 蛋C末端保守序列：D/N-G-V-L-T-T/V-X-V/A 。小分子量热休克蛋白（small heatsHSP家族的蛋白具有多种不同的生物学功能，但都具有分子伴侣的活性，ATP参与。这一类蛋白的结构研究表明它们往往通过能与变性的蛋白质底物作用并不依赖于 形成特定的寡聚结构来发挥功能， 形成十二聚体。HSP 16.3是迄今为止发现的几种原核生物的

4、了解还很少。2. Tag 酶女0 M.Janneschii HSP 16.5 形成二十四聚体， 小麦 HSP 16.9sHS P之一，目前，对sHSP功能，作用机制实验原理1超声波处理法破碎细菌处理的效果与样品浓度和使用频率有关。破借助超声波的震动力破碎细胞壁和细胞器。碎微生物细菌和酵母菌时时间要稍长，使用时应注意降温防止过热。2、Ni-NTA 亲和层析（Ni-NTA Affinity Chromatography ）（1）金属螯合亲和层析金属螯合亲和层析介质上偶联的配基亚氨基二乙酸钠（IDA ），在偏碱的环境中容易于二价金属离子如 Zn2 + , Cu2 +, Ni2 +发生可逆螯合吸附，

5、二价金属离子又与流动相中 的半胱氨酸、组氨酸、咪唑等物质发生可逆性的螯合吸附。金属离子在螯合介质与分离分子间起着桥梁的作用，金属离子一端与螯合介质连接，另一端与被分离组分结合。这两种结合方式都是可逆的，可以根据需要从不同结合部分解析下来。例如，以EDTA为洗脱剂可以从金属离子与螯合介质的结合部位洗脱下来，以咪唑为洗脱剂可以从金属离子与被分离分子的结合部位洗脱下来，利用这一特性可以分离不同用途的蛋白质。(2) Ni IDA 和 Ni NTA IDA只有三个金属螯合位点，与金属离子结合并不紧密，由此导致最后纯化产物不纯等问题。 而Ni NTA中，NTA是一个四配位基的螯合剂，可以与镍离子六个配位基

6、中的四个螯合， 镍离子剩下的两个配位基则与目标蛋白六个组氨酸残基(6x His tag)结合，在较高强度的洗脱条件下，仍保持良好的结合力。半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子产生结合作用， 但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。HjOCHIj馆/产EI孩V aB匕:FHOHjONpNTANidDA不同的配基与镍离子的螯合(左)Ni氨三乙酸配合物，NTA与镍离子中四个配位基结合，结合更紧密;(右)Ni亚氨二乙酸配合物，IDA与镍离子的三个配位基结合。3、紫外吸收法测蛋白质含量蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有 吸收紫外光的性质。吸收高峰在280n

7、m处，其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在 238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液 的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。4、透析(Dialysis )(Diffusi on)经由半透膜的两端及透析液中的分子，经浓度的差异而互柤产生自由扩散 的现象叫作透析作用。通常将半透膜制成袋状，将生物大分子溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中， 样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋 外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。透析技术可用于除盐、除生物小分子杂质和浓 缩样品。透析的动力是扩散压，

8、扩散压由跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度正比于 膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温 度，通常是4C透析，升高温度可加快透析速度。5、SDS PageSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。 SDS即十二烷基磺酸钠(CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+), 是一种阴离子表面活性剂即去污剂， 它可以断开分子内和分子间的氢键， 破坏蛋白质分子的 二级和三级结构，强还原剂 b-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。电泳样品加入样品处理液后，要在沸水浴中

9、煮35 min，使SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构。SDS与蛋白质结合后使蛋白质-SDS复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子，这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异。样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于控制电泳过程。 另外样品处理液中也可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以沉入样品凹槽底部。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以用于未知蛋白分子量的测定，在同一凝胶上对一系列已知分子量的标准蛋白及未知蛋白进行电泳，测定各个的标准蛋白的电泳距离（或迁移率），并对各自分子量的对数

10、（log Mr）作图，即得到标准曲线。测定未知蛋白质的电泳距离（或 迁移率），通过标准曲线就可以求出未知蛋白的分子量。SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成 分别对应于各个亚基的几条带。SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。6.天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native Gel ）天然聚丙烯酰胺电泳， 是指未加SDS也未经强还原剂如 DDT和3 -

11、巯基乙醇处理的天 然聚丙烯酰胺凝胶电泳。目的是为了使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷。利用蛋白质分子中带有净电荷的数目差异，以及分子质量、形状不同，在电场中泳动的速度和方向有区别，从而达到分离的目的。 在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生 物活性。 与其他方法相比，Native Gel电泳分辨率较低，使用合适浓度和孔径的凝胶、有 足够长度的凝胶、小体积加样等方法，可提高分辨率。1.细胞收集和破碎 材料： 设备：四、材料、仪器与步骤经诱导表达目的蛋白（HSP 16.3）的大肠杆菌大型低温离心机，高速低温离心机，细胞超声破碎仪，4 C /-20 C冰箱Buffer A (25

12、mmol/L Tns?HCI, , 0.15mol/L NaCI , pH 8.0)试剂：实验步骤：（1） 将150ml菌液（经诱导表达目的蛋白的大肠杆菌）转入大离心瓶中（2tubes/组），离心 收菌，5000rpm , 10min, 4oC （留沉淀）;（2）配制Buffer A缓冲液：配制时先分别加入 4.31gTris.HCI和1.51gNaCl，用去离子水定 容至 500ml, HCl 调 pH 值至 8.0,配制成终浓度为 25mmol/L Tris?HCl , 0.15mol/L NaCl , pH 8.0的溶液。（3） 倒掉上清，将离心管中的菌体沉淀悬于40 ml Buffer

13、 A缓冲液（pET系统用Buffer A , 25mmol/L Tris?HCl, 150mmol/L NaCl , pH 8.0）,再移至小烧杯中；（4） 超声破碎细菌（冰浴）：工作功率400KW,工作5秒，停止5秒，每次50个循环，共3 次，每次间歇1 2min ;超声注意事项:*盛装菌液的小烧杯要放在冰盒底部，防止超声过程中冰融后烧杯移位;*探头要距离烧杯底部有一定距离，大约5mm，但又不能离底部过远;*探头一定要插入液体内方能开机，严紧空载开机；工作时钻头要在液面中间，保证超声效果;*超声过程中冰会融化，应及时添加冰。*所用超声机适合破碎 30ml以上的溶液;*基本参数都已设定，不要随

14、便修改已设定好的参数，开机后只需调整功率输出旋钮,把输出功率调整到 200W左右；一般情况下工作功率设定在 200W左右即可，但由于本作超声机钻头较细，加大功率至300W ;*在使用中出现的问题应及时通知老师;*超声破碎后，要用去离子水再超声五次， 擦干探头，防止残留菌液结垢。12000rpm，30min, 4oc；30ul的buffer A中，4 C冰箱保存，分别对上清和沉淀留样，通过 ,鉴定表达情况和蛋白可溶情况。(4) 将破菌产物离心，(5) 留上清，沉淀溶于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳2. Ni NTA亲和层析蛋白材料：高速离心得到的蛋白上清， Ni-NTA介质设备：制冰机，4C /-20

15、 C冰箱，亲和层析柱，电磁搅拌器，紫外分光光度计试剂：Buffer A（25mmol/L Tris?HCI, , 0.15mol/L NaCl , pH 8.0）1mol/L咪唑溶液50mmol/L NiSO4洗脱液1 （20mM咪唑）: 在20ml的buffer A中加入400卩l 1mol/L咪唑， 配成终 浓度为 25mmol/L Tris.HCl , 150mmol/L NaCl , 20mmol/L 咪唑，pH8.0的溶液；20mmol/L 咪洗脱液2 （200mM 咪唑）: 在16ml的buffer A中加入4ml 1mol/L咪唑， 配成终浓 度为 25mmol/L Tris.H

16、Cl , 150mmol/L NaCl , 唑，pH8.0的溶液。实验步骤:(1)处理介质：向柱中加入 1ml NTA介质后，按下列顺序清洗和处理层析柱： 水(3柱体积，约 20ml) Buffer A (10ml)平衡介质。加入蛋白样品：加入40ml超声破菌后的蛋白上清样品(保留穿过液)最后保留30卩l穿过液样品用作 SDS PAGE检测。洗脱杂蛋白：用10ml buffer A洗脱介质。将柱用buffer A装满后放入4 C冰箱过夜。用10ml buffer A 洗脱介质。去离子，手动加液,（4）洗脱目标蛋白：用 20ml洗脱液1 （20mM咪唑）洗脱介质，保留30卩l穿过液样品用作SDS

17、 PAGE检测；用20ml洗脱液4 （ 200mM咪唑）洗脱介质，手动收集， 每管1ml。以buffer A为参比，测量上述三次洗脱收集的洗脱液的OD280。（5）NTA Ni2 +琼脂糖再生：10ml 1M 咪唑 20ml去离子水 10ml 50mMNiSO4 10ml 20 % 乙醇一一 加入20%乙醇，封口， 4C保存。3.透析材料：固体NaH2PO4，透析袋，OD280峰值处的洗脱液样品 （本组由于没有得到目标蛋白,用的是9-2组的。）实验步骤:（1）配制透析缓冲液：用 NaH2PO4和Na2HPO4配置1L , pH7.0的透析液（两组共用透 析液）。准备透析袋：将透析袋剪切成适当长

18、度（10 20厘米），在蒸馏水中煮10分钟，冷却后储放在水中。（老师准备好）透析：透析袋凉至室温，中间打结或系皮筋，用滴管向透析袋中加入 OD280值最高一管样品约1ml，两端封口，放入透析液中过夜。注意事项:透析袋中加入蛋白样品的量最好为一半体积，因为透析时袋外液体受渗透压进入袋内，使透析袋膨胀;为避免透析袋涨破，不宜加入过多样品，实际上加了约0.5ml。4. Cross Linking材料：经透析的样品设备：微量恒温器试剂：Special sample buffer （含 4%戊二醛，终浓度 1%）, 0.1M Tris HCl , pH 7.0实验步骤：取30卩l透析样品，加入 15卩l

19、 special sampie buffer,在室温放置 20min，再加5卩l 0.1M Tris HCl 停止交联（stop）, pH7%。5. SDS P AGE材料：前面实验所留的样，包括破菌上清样品，破菌沉淀样品，挂柱穿过样品，透析交联 样品，不同浓度咪唑洗脱液洗脱蛋白回收样品。蛋白电泳marker设备:蛋白电泳仪等电泳设备，Pip ette，微量恒温器（用于样品处理），电磁搅拌器试剂:A 液(Lower buffer) :18.17g Tris 0.4g SDS, pH 8.8 (HCl)力口 H2O 到 100ml (1.5MTris-HCl buffer)B 液(Upper b

20、uffer) :6.06g Tris 0.4g SDS, pH 6.8 (HCI)力口 H20 到 100ml (0.5MTris-HCl buffer)C液(30%丙稀酰胺)：30g丙稀酰胺(acrylamide)0.8g N,N -亚甲双丙烯酰胺(Bisacrylamide)加水到 100mlD 液(10%过硫酸铵)(fresh): 0.1g ammonium persulfate ,力口 H2O 至U 1ml。样品处理液 1 X sampie buffer: 50mM Tris-HCl(pH 6.8)100mM DTT(or 5% Mercaptoethanol) 2% SDS 0.1%

21、 溴酚蓝(Bromophenol blue) 10% 甘油(Glycerol)Tris-甘氨酸电泳缓冲液： 0.025mol/L Tris 0.25mol/L 甘氨酸(pH为8.3)0.1% SDS染色液：0.25g考马斯亮蓝 R-250溶于50ml甲醇中,加入8ml乙酸和42ml H2O定容至100ml。脱色液：30% 乙醇，10% 乙酸，加H2O定容至1000ml。实验步骤：(1)SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制：根据厂家说明书安装玻璃板，在高玻璃上做好刻度线，玻璃板矮面朝外。确定所需凝胶溶液体积，按下表给出的数值在一小烧杯中按所需 丙烯酰胺浓度配制一定体积的分离胶溶液。依次混合各成分。一旦加入

22、TEMED ,马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。TEMED or D was added last.(2)配制分离胶(15% running gel):A4.5mlC9mlH2O7.4mlTEMED0.02mlD(fresh)0.07mlTotal18ml迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，至刻度线高度，留出灌注积层胶所需 空间(梳子的齿长，再加 1cm)。用注射器小心地在丙烯酰胺溶液上覆盖一层水(水 封)。将凝胶垂直放置于室温下。分离胶聚合完全后(1520min),倾出覆盖层液体，用纸巾的边线吸净残留液。(4)按下法制备积层胶：按下表给出的数据在另一个小烧杯里制备一定体

23、积及一定浓度的丙烯酰胺溶液，依次混合各成分。一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下一步操作。在已聚合的分离胶上直接灌注积层胶，立即在 积层胶溶液中插入干净的 Teflon梳子。小心避免混入气泡，再加入积层胶溶液以充 满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。配制积层胶(3% running gel )：B2.0mlC0.8mlH2O5.2mlTEMED0.01mlD(fresh)0.04mlTotal8.05mlTEMED or D was added last.(5)蛋白电泳样品处理：将10卩l 1 X sample buffer加入10卩l洗脱蛋白样品中，在100

24、 C 加热5分钟，以使蛋白变性。标准蛋白Marker也在100C中加热5min。(6)电泳：积层胶聚合完全后，小心移出梳子，将玻璃板间的胶带去掉，玻璃板高面朝 外,固定于电泳装置上，上、下槽各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。按预定顺序加样，每样品加20卩l，使用专用的上样枪头，每加完一个样品在下槽缓冲液中洗涤加样注射器。将电泳装置与电源相接(正极应接下槽)，调节电压为 200V。至溴酚蓝到达分离胶底部，然后关闭电源。从电 泳装置上卸下玻璃板，放在纸巾上，用小钢尺把胶刮下来。用考马斯亮蓝对 SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色：考马斯亮蓝R250是一种三苯甲烷纺织

25、染料。可将凝胶放在这一染料的甲醇-乙酸浓溶液中浸泡数小时，然后经过长 时间的脱色而使过量染料从凝胶上扩散出去。用至少5倍体积的染液浸泡凝胶，放在平缓摇动的平台上于室温染色2小时。(8)脱色，观察结果：倒出染色液，将凝胶浸泡于不加染料的甲醇-乙酸溶液中，平缓摇动4- 8小时，其间应更换脱色液三四次。6. Native GelMarker, BSA不同浓度咪唑洗脱液洗脱蛋白回收样品，透析样品，标准蛋白材料：设备:试剂:蛋白电泳仪等电泳设备，Pip ette，冰盒A 液(Lower buffer ): 18.17g Tris , pH 8.8 (HCl)力口 H2O 到 100ml (1.5M Tr

26、is-HCl buffer) B 液(Upper buffer): 6.06g Tris , pH 6.8 (HCl)力口 H2O 到 100ml (0.5M Tris-HCl buffer)C液(30%丙稀酰胺)：30g丙稀酰胺(acrylamide)0.8g N,N -亚甲双丙烯酰胺(Bisacrylamide)加水到 100mlD 液(10%过硫酸铵)(fresh): 0.1g ammonium persulfate ,力口 H2O 至U 1ml。样品处理液 sam pie buffer: 0.1M Tris-HCI( pH 6.8) 0.2% 溴酚蓝(Brom op he nol bl

27、ue), 2mg 20% 甘油(Glycerol) Tris-甘氨酸电泳缓冲液： 0.025mol/L Tris 0.25mol/L 甘氨酸(pH 为 8.3)牛血清白蛋白：1mg BSA溶于1ml去离子水中。BSA*注:实验步骤： 基本和(1)native gel的试剂里不含任何的 SDS或者DDT等还原性强的试剂。SDS- PAGE操作一样，但是有下列几点不同：分离胶配制浓度为7.5%,而不是15%,浓缩胶配方一样。配制分离胶(7.5% running gel):A4.5mlC4.5mlH2O8.9mlTEMED0.02mlD(fresh)0.07mlTotal18mlTEMED or D

28、 was added last.(2)蛋白样品处理：取15 l蛋白样品加入5卩l的3X sample buffer，混匀，不用加热，直接上样。目标蛋白浓度最高的一管样品 紫外分光光度计，pip ette，微量恒温器7.测活材料：设备： 试剂：缓冲液(0.05M Na2HPO4 , 0.1M NaCl , pH7.0), 1M DTT , 2.5mg/ml 胰岛素(insulin ) 实验步骤：1 ml。1.按照下表设计，依次加入各种试剂(最后加insulin )，每一个体系终体积为测活参比液:0.05M Na2H PO4760ul0.1M NaCl (pH 7.0)1M DTT80ullnsu

29、lin(2.5mg/ml)200ul2. 以缓冲液(0.05mol/L Na2HPO4 , 0.1M NaCl，pH7.0)为空白，测反应物在 360nm处的浊度，以检测胰岛素的聚集。每组测14min，每10s记一个数据。3. 按照下表加入试剂进行测活。测活样品液：0.05M Na2 HPO4740ul0.1M NaCl (pH 7.0)P rotein sam ple20ul1M DTT80ulInsulin(2.5mg/ml)200ul每组测 14min，每10s记一个数据。4.以缓冲液(0.05mol/L Na2HPO4 , 0.1M NaCl，pH7.0)为空白，测反应物在 360nm

30、处的浊 度，以检测胰岛素的聚集。1.目的蛋白的洗脱曲线用 Buffer A+200mM洗脱目标蛋白收集组分，五结果与讨论咪唑(25mmol/L Tris?HCI, 0.15mol/L NaCI , 200mmol/L 咪唑，pH 8.0) 测OD280数据，见表1。由此数据作图，见图2。表一、200mM 咪唑洗脱的各管的 OD280值管数OD28010.36520.66930.64340.53350.47360.38670.37680.326200mM咪唑洗脱的各管的OD280OOOOOOOO图 2、200mM咪唑洗脱的各管的 OD280 用缓冲液 B(25mmol/L Tris?HCI, 0

31、.15mol/LNaCI, 200mmoI/L咪唑，pH 8.0)为空白对照，各管收集组分在紫外分光光度计上测定吸 光度OD280,以OD280为纵座标，收集组分按顺序为横座标作图，可以从图中直接得出 第2管蛋白洗脱量最多即蛋白浓度最高。从OD28O的数据可以看出，各管的 OD28O都在0.7以内，并不太高。鉴于 我们是直接取用的发酵罐的菌液，而且之前的实验结果显示我们的细菌浓度 较高，所以我们测 OD280前共对样品稀释了 16倍。综合考虑稀释倍数，我 们的数据结果就和别组同学的数据结果差不多了。在洗脱的过程中我们遇到最大的问题就是洗脱的速度特别的慢，从一开始用水洗柱子的时候速度就比别组慢，

32、后来助教说是因为我们的柱子装的太紧。有时候慢到20多秒一滴，我们就不得不在助教的帮助下把柱子弄松。我们猜测柱子的问题不仅仅是影响了实验进度，对洗脱效果也会有一定影响，比如洗脱的各管的 OD280峰就不突出，不过对后面的实验还不至于产生大的 影响。2. SDS PAGE凝胶电泳结果第一块胶孔号12345678样品Mark erCrosslin k(o urs)Crosslink conrolboiledCross- link( 别组 的)Crosslink contro lboiled没透 析的上样 量(ul )1530303030303030明显的可以看出 我们的带走的很不齐，所以dimer的存在。没有透析的样品marker不能起到对图3