病毒与细胞的相互作用

1、第24章 病毒与细胞的相互作用,制作：临沂大学生命科学学院 微生物与免疫学教研室,第24章 病毒与细胞的相互作用,第一节 病毒的细胞培养 第二节 病毒与细胞的相互作用,目的要求： 1、掌握病毒的细胞培养的特点和 方法 以及病毒与细胞的相互作用机制。 2、了解病毒持续性感染的机制和干扰素的产生和作用机理 。 重点：病毒的细胞培养的特点、方法和病毒与细胞的相互作用机理 难点：病毒与细胞的相互作用机理和病毒持续性感染的机制和干扰素的产生和作用机理,第一节 病毒的细胞培养,病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养

2、（细胞培养,一、动物接种,接种后通常以动物发病、死亡作为感染的指标。 按病毒侵袭部位不同选择适当的接种途径。嗜神经病毒接种在小鼠的脑内。痘苗病毒和单纯疱疹病毒接种于家兔角膜,动物接种的优缺点,优点：不需要复杂的仪器设备； 技术简单； 易成功 缺点：个体差异大 价格昂贵 数量有限 需要隔离畜舍,二、鸡胚接种,一种比较经济简便的方法,鸡胚接种的优缺点,优点：技术简单、来源充沛、价格低廉、数量可大，不需特殊设备 缺点：很多病毒不能适应，主要是哺乳动物的病毒,三、细胞培养,细胞培养(cell culture)是指利用机械、酶或化学方法使动物组织或传代细胞分散成单个乃至24个细胞团悬液进行培养,一)细胞

3、培养的优点,每个细胞生理特性基本一致，对病毒易感性相等 无个体差异，准确性和重复性好 严格执行无菌操作 细胞培养本身就能显示病毒的生长特征 应用空斑技术可进行病毒的克隆化,二）细胞的类型,根据细胞来源、染色体特征及传代次数，可分为三种类型： 1.原代细胞(primary cell)：动物组织经胰蛋白酶消化处理，使细胞分散而获得的单个细胞，再生长于培养器皿中。大多数组织均可制备原代细胞，但生长的快慢及难易程度不一,二）细胞的类型,2.二倍体细胞(diploid cell strain)：将长成单层的原代细胞消化分散成单个细胞，继续培养传代，其染色体数与原代细胞一样，保持其二倍染色体数目的细胞，称

4、为二倍体细胞。但巨噬细胞、神经细胞等体外培养时一般不分裂，很难获得二倍体细胞株,二）细胞的类型,3.传代细胞系(diploid cell line)：能在体外持续增殖传代的细胞，大多数由癌细胞或二倍体细胞突变而成，染色体数目不正常，为异倍体。 优点：传代及培养方便 缺点：对有的分离野毒（样本中的病毒）不敏感 由于担心致肿瘤的潜在危险，传代细胞一般不能用于制备疫苗。 常用传代细胞系：hele(人子宫癌细胞)，vero(非洲绿猴肾细胞)，bhk21(乳仓鼠肾细胞)，pk15(猪肾细胞)等,三）细胞培养的方法,常用的有静置培养和旋转培养两种 1.静置培养(stationary culture)：实验

5、室常用。将消化分散的细胞悬液装瓶，5%co2温箱静置培养，数天后细胞沉降并贴附在玻面上生长分裂，最后长成单层。哺乳动物和禽类的细胞培养温度一般为37,三）细胞培养的方法,2.旋转培养(roller culture)：大规模生产疫苗。细胞在玻瓶内生长时，玻瓶不断缓慢旋转，细胞贴附于玻瓶四周，长成单层。 基本方法与静置培养基本相同，不同之处是培养的细胞不断缓慢旋转（5-10r/h,三）细胞培养的方法,另外为满足某些特定需要可采取悬浮培养和微载体培养两种 1.悬浮培养(suspension culture)：搅拌使细胞处于悬浮状态，并不断补充营养和矫正ph值，使之生长或存活，适用于不需要贴壁生长的细

6、胞系。如ns-1（一种骨髓瘤细胞系） 1.微载体培养(microcarrier culture)：在悬浮培养的基础上，结合微载体的培养技术，微载体直径在100-200m的微粒，对细胞无毒，细胞附着其上生长成单层，由于单位体积表面积大，所获得的细胞数多。对规模化细胞生产和疫苗生产有较大吸引力,第二节 病毒与细胞的相互作用,杀细胞感染 非杀细胞感染 引致持续感染，对细胞代谢无影响。 产生干扰素,病毒的种类千差万别，宿主的细胞的种类也多达200多种，病毒与宿主细胞之间的作用的表现形式各异。 一、病毒与细胞相互作用的类型 病毒感染可分为杀细胞及非杀细胞两大类。并非所有的病毒感染都能产生和释放子代病毒颗

7、粒。宿主细胞感染病毒发生的变化可能是细胞死亡或细胞转化，也可能是病毒非生产性感染，或称顿挫感染,某些种类的细胞是允许性的，可让病毒完成复制过程；而另一些则阻断了病毒的复制过程的某个环节，此类细胞称为非允许性的。 病毒感染允许性及非允许性细胞均可产生细胞的病理变化,最重要的非生产性的病毒与细胞的相互作用是持续感染。 持续感染（persistent infection）：是指持续长时间的感染。在感染过程中不形成感染性的病毒颗粒，可能是病毒的基因组被整合到宿主细胞dna内，或以附加体形式存在。 潜伏感染的细胞在某些情况下并不释放病毒颗粒，在被激活的情况下则可变为生产性的,二、病毒引致的杀细胞变化,一

8、)细胞病变(cytopathic effect,cpe) 由病毒感染导致的细胞损伤。cpe能在光学显微镜下观察,50%组织细胞感染量（tcid50,能够使半数组织细胞在一定条件下发生细胞病变的病毒量。用于判定病毒的毒力,细胞病变的表现因病毒与细胞的种类而异，有多种形式,细胞圆缩：如痘病毒和呼肠孤病毒等； 细胞聚合：如腺病毒； 形成合胞体：细胞融合形成，如副粘病毒和疱疹病毒； 细胞肿大： 包涵体：有些病毒可能形成,cpe,细胞肿大,细胞圆缩,形成合胞体,正常细胞,cpe,cpe观察,cpe观察,正常单层a72细胞,接种犬冠状病毒（ccv）后形成合胞体的的单层a72细胞,细胞折光性，变圆，局部全层

9、，死亡脱落，如：肠道病毒,细胞聚集成丛，似葡萄串状，细胞间常有细丝状间桥连接，细胞变圆或膨大，如：腺病毒,细胞融合形成多核的巨细胞，称为“合胞体”，如副粘、牛白血病病毒等,胞浆内有空泡形成，如：猴病毒sv40、呼肠孤病毒等,1)病毒对宿主细胞膜的影响,一些具有有融合活性的表面蛋白的有囊膜病毒能够启动细胞之间的融合，形成多核细胞如合胞体病毒,合胞体（syncytia）：是病毒感染后导致感染细胞及相邻细胞细胞膜融合的产物，表现为若干细胞的相邻细胞膜消失，成为多核巨细胞,2)病毒对细胞骨架的影响,许多病毒的感染会导致细胞骨架纤维系统（细胞骨架由维丝、中介丝及维管组成）的瓦解 。由于细胞骨架在维持细胞

10、形态中起一定作用，所以病毒引起细胞骨架的改变是受染细胞结构变化的原因之一,病毒引致的细胞凋亡和坏死,细胞的死亡则是因病毒感染引起了细胞的生理性死亡所致，亦即程序性死亡，或称为凋亡(apoptosis)。 凋亡与坏死的细胞有不同的形态变化，凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化。内源性核酸内切酶被激活，将细胞dna降解成180-200dp的片段，可在琼脂糖凝胶电泳时出现特征性的电泳带，称之为“梯带”。坏死的细胞没有内切酶激活所致的变化。 凋亡是宿主细胞的重要防御机制，细胞坏死总是在病毒复制完成之后发生,病毒引起的细胞调亡,空斑试验,将适当浓度的病毒悬液加入单层细胞培养中，当病毒吸附细胞后，再覆盖一层融化的

11、琼脂。病毒在细胞内复制后产生局限性病灶，病灶逐渐扩大，肉眼也能看见，此即空斑试验,cells,空斑是由一个感染性病毒粒子复制形成的，类似于细菌的菌落，称为空斑形成单位(plaque-forming unit，pfu)。病毒悬液中的感染性病毒量以每毫升含有的pfu来表示,空斑试验的用途,1. 测定病毒数量 2. 纯化病毒 单个空斑作悬液，梯度稀释后再作空斑，可获得病毒克隆。 3. 鉴定病毒 不同病毒的空斑具有不同的特征,三、包涵体(inclusion body,定义：是某些病毒感染细胞产生的特征性的形态变化，在普通光学显微镜下可见胞浆或胞核内出现的呈嗜酸性或嗜碱性染色、大小数量不等的圆形或不规则

12、形的团块状结构，称为包涵体,包涵体的性质,病毒成分的蓄积，如狂犬病毒的negri氏体 大量晶格样排列的病毒颗粒组成，如腺病毒的包涵体 细胞变性的产物，不含病毒，如疱疹病毒的包涵体,意义诊断（涂片或组织切片）某些病毒的诊断依据发现包涵体即可确诊狂犬病，小脑或大脑海马角有内基氏小体（圆形或卵圆形的嗜酸性小体）c浆内；喉气管炎c核内。副流感病毒型，c浆内、核内都有,狂犬病毒包涵体（negri body,能产生包涵体的重要的畜禽病毒,四、病毒引致的非杀细胞变化,非杀细胞病毒的感染通常引致持续感染，对细胞的新陈代谢并无大碍，但同时还会产生并释放子代病毒颗粒。 持续感染的细胞大多能继续生长并分裂。 大多持

13、续感染的细胞发生慢性渐进性变化，最终死亡,五、细胞抗病毒的rna干扰,rna干扰(rna interference，rnai)是指细胞利用内源或外源的小分子双股rna片段，特异性地降解同源基因的mrna，从而导致靶基因转录后的基因沉默 (post translational genesilence,ptgs)的现象,六、干扰素（ifn,定义：由病毒或诱生剂刺激机体细胞产生的具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的糖蛋白。 种类：、干扰素。 抗病毒作用：干扰素不直接作用于病毒，而是作用于邻近的细胞，使其产生抗病毒蛋白，这些抗病毒蛋白降解病毒mrna、抑制蛋白合成。 干扰素作用具有宿主特异性，而无病毒特异性,干扰素抗病毒机理,复习思考题,1. 细胞培养有何优点？ 2. 原代细胞、二倍体细胞和传代细胞系的概念。 3. cpe、pfu、空斑、包涵体和干扰素的概念。 4. 试述