生物化学：第十二章 核酸的生物合成

1、生物化学,第十二章 核酸的生物合成,华东理工大学生物化学精品课程组,上海市精品课程系列,第十二章 核酸的生物合成,学习要求,了解核苷酸生物合成代谢途径及核苷酸生物合成的机理。理解用核苷酸生物合成途径筛选融合细胞的原理。 掌握核酸生物合成的模板、原料、能源物质、合成方向、酶。弄清中心法则、复制、半保留复制、不连续复制、转录、反转录、冈崎片段、翻译等的概念。 了解病毒分子结构及繁殖与致癌作用和核酸生物合成间的关系。 了解核酸合成的抑制剂及作用原理,第十二章 核酸的生物合成,12.1 DNA的生物合成,DNA指导下的DNA复制,RNA指导下的DNA复制,DNA的损伤和修复,12.2 RNA的生物合成

2、和加工,12.3 核酸病毒,12.4 核酸生物合成的抑制剂,12.1.1 DNA指导下的DNA复制,分子遗传的中心法则,半不连续复制,原核细胞DNA的复制,半保留复制,DNA复制的起点和方向,真核细胞DNA的复制,DNA复制的一般特征,DNA复制的忠实性,返回,分子遗传的中心法则,DNA是遗传信息的储存和发布者，它在如图的联系中处于中心地位,分子遗传的中心法则,中心法则的几个基本概念 复制：以亲代DNA或RNA为模板，根据碱基配对的原则，在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。 转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则合成RNA，即将DNA所含的遗传信息传给RNA，形成一条

3、与DNA链互补的RNA的过程。 翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的氨基酸顺序的过程。 逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程,返回,半保留复制,以亲代DNA双链为模板以碱基互补方式合成子代DNA，这样新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制,半保留复制,半保留复制,Meselson 和Stahl将同位素15N标记的15NH4Cl加入大肠杆菌的培养基中培养12代，使大肠杆菌的DNA都带上15N的标记，然后将该大肠杆菌转入14N的普通培养基中培养后，分离子一代、子二代、子三代、子四代DNA，进行

4、氯化铯密度梯度离心，实验证明了DNA的半保留复制,半保留复制,返回,DNA复制的起点和方向,1)两个起点，两个生长端的相向复制 DNA每条链有1个复制起点，分别合成1条新DNA，两条新链相向合成，每个生长点只有1条链合成，这种方式存在于线性DNA病毒。 (2)1个起点，1个复制区的单向复制 DNA两条链的复制起始点在同一位置，复制向一个方向运动，两条DNA链均被复制，这种方式偶见于一些环形DNA的复制。 (3)1个起点，两个复制区的双向复制 这种DNA复制方式最为普遍，复制起始于1个位点，形成两个复制区向相反方向运动，在每个复制区两条DNA链均被复制,DNA复制的起点和方向,返回,半不连续复制

5、,DNA双螺旋的两条链是反向平行的，而合成方向只能是53。所以在DNA复制时，1条链的合成方向和复制叉的前进方向相同，可连续复制，称为前导链；而另一条链的合成方向和复制叉的前进方向正好相反，不能连续复制，只能分成几个片段合成，称为滞后链。滞后链的片段叫作冈崎片段，它们合成后再连接起来,返回,原核细胞DNA的复制(E.coli,模板：DNA 引物：RNA 原料、能源物质：NTP，dNTP 酶： 引物酶；DNA聚合酶I、II、III ；DNA连接酶；解链酶；单链结合蛋白；拓扑异构酶 合成方向： 模板链35；合成链53,大肠杆菌三种DNA聚合酶比较,DNA 聚合酶,分子量 每个细胞的分子统计数 5-

6、3 聚合酶作用 3-5 核酸外切酶作用 5-3 核酸外切酶作用 聚合速度 (核苷酸/秒) 功能,DNA 聚合酶,DNA聚合酶 （复合物,103,000 400 + + + 1620 切除引物，修复,88,000 100 + + - 40 修复,830,000 10-20 + + - 2501000 复制,比较项目,DNA聚合酶催化的反应,与DNA合成有关的蛋白因子(E.coli,原核细胞的DNA合成步骤,解旋：由拓扑异构酶解除DNA的超螺旋结构。 解链：由解链酶使双链DNA解开再由单链结合蛋白与单链结合，防止氢键再形成。 识别起点： 由DNA指导的RNA聚合酶即引物酶完成。 生成引物：以DNA

7、为模板在引物酶催化下由DNA转录成。 DNA的生成：在RNA引物3末端上按碱基互补原则经DNA聚合酶III催化生成，其3末端与下一个RNA引物5末端相连,原核细胞的DNA合成步骤,切除引物：由DNA聚合酶 I 催化切除引物，剩下的DNA片段即冈崎片段。 补齐封口：DNA聚合酶 I 利用其DNA聚合酶活性按碱基互补原则沿53方向填补两个冈崎片段之间的缺口。其3末端羟基与下一个DNA片段5末端相连磷酸基，在DNA连接酶催化下形成磷酸二酯键而被连结起来，最终形成DNA模板链的完整新的互补链，此部由NAD+供能,DNA合成的起始与延伸,拓扑异构酶,解链酶,引物酶,前导链的合成 （DNA聚合酶III,切

8、除引物与补齐封口,返回,真核细胞DNA的复制,真核细胞与原核细胞DNA的复制区别在于： RNA引物和冈崎片段较小。 复制速度较慢，这可能与组蛋白的存在使DNA处于稳定的双股状态有关。 复制有多个起点。 DNA聚合酶为，以及线粒体聚合酶。它们仅能催化聚合作用，而没有原核细胞DNA聚合酶所有的外切酶作用。 DNA片段的连接由ATP供能,DNA聚合酶的功能,返回,DNA复制的忠实性,DNA复制具有高度精确性，在大肠杆菌的细胞DNA复制中错误率约为1/1091/1010，即每1091010个核苷酸才有一个错误。这么高的精确性的保证主要与下列因素有关： 1、碱基的配对规律：模板链与新生链之间的碱基配对保

9、证碱基配错几率约为1/1041/105。 2、DNA聚合酶的35外切酶活性的校对功能，使碱基的错配几率又降低1001000倍。 3、DNA的损伤修复系统,DNA聚合酶的自我校正,DNA聚合酶不能从头合成DNA，即不能把两个dNTP连接起来，而只能将一个个核苷酸单位加到形成碱基配对的引物链3羟基上，如果引物链3羟基出现了和模板链错配的碱基，DNA聚合酶就会立即停止前进，并利用35核酸外切酶活性将错配的核苷酸从引物3端切除，只有引物3端重新出现碱基配对时才继续合成DNA。 所以在合成DNA之前必须有正确的碱基配对存在于3端，即DNA聚合酶必须利用RNA引物链来检验3端的碱基配对正确与否，在确认无误

10、后才开始合成,错配校正系统,错配校正系统能发现DNA双螺旋因非互补碱基对间的不对称而产生的变形，它能区分和切除存在于新合成的DNA中错配的核苷酸。E.coli的错配校正系统利用dam基因编码的甲基化酶将DNA碱基序列中的A在N6位甲基化，但新合成的A要晚一些才被甲基化，这使碱基序列只是在刚合成的新DNA链中还没有被甲基化，这就能区别新DNA链和模板链。 参与错配修复的酶与蛋白质： Dam甲基化酶 ； MutH、MutL、MutS蛋白 ；解螺旋酶 ； SSB ；DNA聚合酶 ； 外切酶、 、 ； RecJ核酸酶；DNA连接酶,错配校正系统,返回,12.1.2 RNA指导下的DNA复制(反转录,以

11、RNA指导的DNA聚合酶催化合成DNA是以dNTP为原料及能源物质，以病毒单链RNA为模板，RNA为引物。 反应时模板与引物以氢键相连，在引物3羟基末端开始以53方向进行 DNA的聚合、延伸。合成的DNA以共价键相连，形成DNA-RNA杂合体。在DNA指导的DNA聚合酶催化下以杂合体中的DNA为模板合成一条DNA互补链，形成新的DNA分子,12.1.2 RNA指导下的DNA复制(反转录,12.1.2 RNA指导下的DNA复制(反转录,因发现逆转录病毒的遗传物质而获1975年诺贝尔奖的三位科学家,返回,12.1.3 DNA的损伤和修复,细胞内的DNA可能因物理或化学因素而受到损伤，例如射线辐射、

12、化学诱变剂和受热等。此外，DNA复制产生的误差也可能造成DNA损伤,一）DNA损伤的表现类型,二）DNA损伤的修复机制,返回,DNA损伤的表现类型,碱基改变：水解造成的碱基脱氨基作用可改变碱基配对。UV波长的紫外线和放射性射线可造成DNA链中相邻的两个同股或异股的嘧啶碱基间发生共价交联形成二聚体，在双螺旋区产生变形，干扰了DNA的复制，引起错股合成导致细胞死亡,DNA损伤的表现类型,碱基丢失：因热或酸破坏糖苷键可以造成嘌呤碱基的丢失，水解也能造成嘧啶碱基丢失。 核苷酸插入或缺失：在DNA复制或重组时，嵌入剂可造成DNA的核苷酸增加或减少。 DNA链断裂：电离辐射、自由基或某些化学试剂可使磷酸二

13、酯键断裂，产生3-脱氧核酸片段。 DNA链间共价交联：具有两个功能基团的烷化剂，可使两条DNA链间发生共价交联,返回,DNA损伤的修复机制,光复活 可见光（400nm）能激活细胞内的光复活酶、光裂合酶，它们可分解因紫外线照射而形成的嘧啶二聚体。光复活酶分布广泛，从单细胞生物到鸟类细胞均有之，但哺乳动物细胞缺乏这种酶,DNA损伤的修复机制,光复活机制,DNA损伤的修复机制,切除修复最为普遍 切开：特异的核酸内切酶识别损伤结构，并切断损伤部位两端的磷酸二酯键。 切除：特异的酶或蛋白因子将损伤片段去除。 合成：DNA聚合酶以单链区为模板合成互补拷贝以填补缺口，最后DNA连接酶将新合成的DNA片段的3

14、端和切口5端连接起来。 DNA损伤的类型决定切除修复的具体方式和步骤，具体可分为碱基切除修复和核苷酸切除修复2种方式,DNA损伤的修复机制,碱基切除修复,a）DNA糖基化酶切除损伤的碱基产生无碱基酸 （b）无碱基核酸内切酶在无碱基酸处切开产生切口 （c）DNA聚合酶将无碱基酸切除并填补缺口 （d）DNA连接酶连接切口,DNA损伤的修复机制,核苷酸切除修复,这种方式可以修复DNA发生的几乎所有类型的巨大损伤，包括某些与致癌剂共价结合的碱基,DNA切割酶,DNA解链酶,DNA解链酶,DNA连接酶,DNA连接酶,DNA损伤的修复机制,重组修复,受损伤的DNA在进行复制时，跳过损伤部位，在子代DNA链

15、与损伤相对应部位出现缺口。通过分子间重组，从完整的母链上将相应的碱基顺序片段移至子链的缺口处，然后再用合成的多核苷酸来补上母链的空缺，此过程即重复修复。并非完全校正,DNA损伤的修复机制,SOS修复 指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，又称倾错性修复（Error-Prone Repair,返回,12.2 RNA的生物合成和加工,在生物界，RNA合成有两种方式：一是DNA指导的RNA合成，此为生物体内的主要合成方式。另一种是RNA指导的RNA合成，此种方式常见于病毒,原核细胞RNA的生物合成,真

16、核细胞RNA的生物合成,RNA指导的RNA合成(RNA复制,DNA指导的RNA合成(转录,返回,原核细胞RNA的生物合成,1960年，RNA 聚合酶被发现。在E.coli中，RNA 聚合酶催化RNA的合成需要： 模板：双链或单链 DNA 活性单体物质：四种NTP 二价金属离子：Mg2+或Mn2+ ，在生物体中发现的是Mg2+ 合成方向：5 3,区别RNA与DNA的合成,RNA的合成与DNA合成的不同在于： 转录不需要引物 只转录DNA 分子中的一个片段(称为操纵子operon) 双链DNA中只有一条链具有转录活性(称为模板链) RNA聚合酶无校对功能,不对称转录,模板链：双链DNA中具有转录活

17、性的的链称为模板链，又称反义链（或负链）。 编码链：双链DNA中无转录活性的链称为编码链，又称有义链（或正链,RNA聚合酶(E.coli,由5种亚基2组成全酶；没有、亚基的酶称为核心酶，只催化链的延长；称为起始因子，能识别DNA链的转录起始信号（称为启动子,RNA聚合酶(E.coli,解螺旋,恢复螺旋,转录泡,模板链,编码链,RNA转录过程,RNA转录由起始、延伸、终止三个阶段组成。 起始：RNA聚合酶在亚基的引导下结合于启动子；DNA双链局部解开；在模板链上通过碱基配对合成最初RNA链 延伸：核心酶沿着DNA链由3 5的方向移动，转录区间的DNA双链解螺旋，而转录完的区间DNA又恢复双螺旋结

18、构 终止：核心酶到达终止子，RNA与核心酶从DNA上脱落,RNA转录的起始,RNA转录的延伸,RNA转录的终止,转录终止信号有两种： 弱终止子：依赖因子的终止，NusA蛋白识别DNA链上的终止信号，在因子帮助下终止。 强终止子： （1）在终止点之前具有一段富含G-C的回文区域。 （2）富含G-C的区域之后是一连串的dA碱基序列，它们转录的RNA链的末端为一连串U连续6个,不依赖因子的终止子：含富GC的回文序列和寡聚U序列,返回,茎环结构,真核细胞RNA的生物合成,真核生物的RNA聚合酶主要分布于细胞核内，RNA合成也就主要发生在细胞核中,RNA转录产物的加工,原核生物的mRNA转录后一般不需要

19、加工，转录的同时即进行翻译（半寿期短）。 但在真核细胞内，由RNA聚合酶合成的原始转录物往往需要一系列的变化，包括链的裂解、5和3末端的切除和特殊结构的形成、核苷的修饰、以及拼接和编辑等过程，才转变为成熟的RNA分子。此过程总称为RNA的成熟或称为RNA的转录后加工。 包括rRNA前体的加工、tRNA前体的加工、真核mRNA前体的加工,rRNA前体的加工,加工过程：1、剪切作用：需核酸酶参与。 2、甲基化修饰：修饰在碱基上。 3、自我剪接：一种核酶的作用。 原核rRNA加工：rRNA含非转录的间隔区，其产物中含tRNA 真核rRNA加工： 1.5S自成体系加工少，无修饰和剪接。2.45S加工中

20、含剪切和甲基化修饰，需核酸酶,rRNA前体的加工(原核,甲基化,核酸内切酶,核酸外切酶,rRNA前体的加工（真核,tRNA前体的加工,包括：核酸外切酶从两端向内切去多余序列；在3-端加CCAOH序列； 核苷酸的修饰与异构化；核酸内切酶切除居间序列,真核mRNA前体的加工,hnRNA被剪接，把内含子（DNA上非编码序列）转录序列剪掉，把外显子（DNA上的编码序列）转录序列）拼接上，真核生物一般为不连续基因。 3端添加polyA “尾巴”。 5端连接“帽子”结构（m7G5ppp5NmpNp-）。 分子内部的核苷酸甲基化修饰,真核mRNA前体的加工,因发现断裂基因而获1993年诺贝尔生理学奖的Ric

21、hard J Robert and Phllip A Sharp,返回,RNA指导的RNA合成,概念：RNA病毒以自身RNA为模板合成与自身RNA完全相同RNA分子的过程称为RNA的复制。 两个阶段： （1）病毒RNA可充当mRNA，利用寄主中的核糖体合成外壳蛋白和复制酶的亚基。 （2）复制酶的亚基与来自宿主细胞的亚基自动装配成RNA复制酶，进行RNA复制，通常以分子中单链RNA为模板（正链），复制出一条新的RNA链（负链），然后以负链为模板复制出大量正链，再与外壳蛋白组装成新的病毒颗粒,RNA指导的RNA合成,RNA复制酶的催化性质： 以四种NTP为底物； 专一性地选择病毒RNA为模板； 按

22、5 3的方向合成病毒RNA； 无外切酶活性（即无校对功能,病毒RNA的复制方式,1、病毒含正链RNA：进入宿主细胞后先进行病毒RNA复制酶和有关病毒蛋白质的合成（借助于宿主细胞的蛋白质合成体系），然后进行RNA的复制，再装配病毒颗粒。如：噬菌体Q和灰质炎病毒。 2、病毒含负链RNA和复制酶：这类病毒进入宿主细胞后，先进行RNA的复制合成正链RNA，再以正链RNA为模板合成病毒蛋白质RNA，然后装配病毒颗粒。如：狂犬病病毒、马水苞性口炎病毒。 3、病毒含双链RNA和复制酶：这类病毒进入宿主细胞后，以双链RNA为模板，通过不对称复制产生正链RNA，并以正链RNA为模板合成病毒蛋白质，然后再合成负链

23、RNA并形成双链RNA，再装配病毒颗粒。如呼肠病毒。 4、致癌RNA病毒：如后所述,返回,12.3 核酸病毒,核酸生物合成的一般规则,DNA病毒,RNA病毒,病毒致癌说,返回,核酸生物合成的一般规则,绝大多数细胞DNA和RNA的合成，都是按照Watson-Crick 碱基互补的原则，通过拷贝预先存在的DNA链（模板链）来产生的。 核酸链的合成方向只有一个：5 3。 特异的聚合酶催化合成DNA或RNA。 致癌的DNA与RNA病毒的繁殖与致癌作用是核酸生物合成的具体化,返回,病毒致癌说,1910年，F.P.Rous研究鸡肿瘤时发现，用滤纸滤掉细胞后的液体可诱发其它鸡的癌变，提出病毒致癌说（1966

24、年或诺贝尔医学奖） 1958年B.Dulbecco用乳头瘤病毒SV40证实病毒感染正常细胞，可以将自己的遗传物质整合入宿主细胞的DNA中，从而在分子水平阐明了病毒致癌说（1975年获医学诺贝尔奖,返回,DNA病毒,正常细胞受到DNA肿瘤病毒感染后，发生染色体变异、永久性的形态改变、失去接触抑制、增殖加速、产生新的抗原从而具有形成肿瘤的能力。 DNA病毒吸附于宿主的细胞膜而进入细胞后，在细胞膜处脱去核壳蛋白，DNA 进入细胞核中。其一部分或全部可整合于宿主细胞核的DNA分子中，形成变异的DNA。整合后的DNA可以完整分子的形式一起复制，转录。它使宿主细胞发生某些特征性改变，最终转化成肿瘤细胞,返回,RNA病毒,RNA病毒不含DNA，绝大多数病毒RNA是单链的，而且都是线状分子。 RNA病毒中，RNA是其遗传信息的携带者，通过RNA的复制，传递遗传信息。通常病毒RNA复制过程包括:基因组RNA转录为mRNA，mRNA翻译为病毒特异性蛋白质，基因组RNA复制和病毒装配与释放。病毒mRNA的合成在病毒复制过程中处于核心地位。 根据病毒粒子的RNA和指导病毒蛋白质合成的mRNA之间关系，把RNA病毒分为：正链