早期宫颈癌中出芽现象与肿瘤复发的相关性及分子机制研究

1、早期宫颈癌中出芽现象与肿瘤复发的相关性及分子机制研究第一部分肿瘤出芽预测早期宫颈癌复发目的明确肿瘤出芽在早期宫颈癌术后复发风险预测中的作用。方法回顾性分析2008 年 1 月至 2014年 12 月我院根治性手术治疗的早期宫颈癌(figoa2-a期),复查 he切片 , 统计包括肿瘤出芽在内的临床病理参数; 出芽定义为肿瘤浸润性最前端出现的单个肿瘤细胞或不超过5 个细胞的小瘤巢 , 选取出芽密集区于 20 倍物镜 ( 奥林巴斯 bx51,视野面积 0.95mm2)下计数。wilcoxon 秩和检验分析肿瘤出芽个数与宫颈癌侵袭性表型间的相关性。受试者工作特征 (receiver operatin

2、g characteristics,roc)曲线检验肿瘤出芽个数对早期宫颈癌术后复发的预测价值, 并选取临界值将研究人群分为低级别出芽(low-grade tumor budding,ltb)组及高级别出芽 (high-gradetumor budding,htb) 组。多因素 logistic回归分析影响早期宫颈癌盆腔淋巴结转移的独立危险因素;cox 比例风险回归模型分析影响早期宫颈癌复发和死亡的独立危险因素。kaplan-meier 法绘制 ltb组及 htb组无瘤时间生存曲线 ,log-rank检验比较两组间复发风险差异。 联合 htb及经典复发危险因素建立新的复发预测模型 ,log-r

3、ank检验及 roc分析检验新建模型的预测效能。结果 1. 最终入选早期宫颈癌643 例。 2. 早期宫颈癌中肿瘤出芽个数与肿瘤分化程度 (p=0.008) 、figo分期 (p =0.004) 、肿瘤大小 (p=0.002) 、间质浸润深度 (p= 0.022) 、血管淋巴管间隙浸润 (p<0.001) 及盆腔淋巴结转移 (p<0.001) 显著正相关。 3.htb 是盆腔淋巴结转移 (or = 2.632,p=0.01) 的独立危险因素 ; 同时也是早期宫颈癌患者术后复发 (hr = 4.711;950%ci:3.051-7.275;p<0.001) 及死亡 (hr= 2

4、.880,p = 0.001) 的独立危险因素。 4.htb 联合经典复发危险因子共建立了 9 个新的复发预测模型 ( 称为 model 1-9), 其中mode15采用 htb、肿瘤最大径 4cm、浸润宫颈间质外 1/3 层以及淋巴管血管间隙浸润四项作为中危因子且定义满足任意两项为复发中危人群 , 其预测能力最强 (roc曲线 auc = 0.752); 与经典模型相比 ,此包含四项中危因素的新模型不仅auc值更大 (0.752 vs 0.667),且敏感性 (0.730 vs 0.656)及特异性 (0.769 vs 0.679)均得以提升。结论 1. 肿瘤出芽与宫颈癌高侵袭表型相关。 2

5、.htb 是早期宫颈癌术后复发及死亡的独立危险因素。 3.htb、肿瘤最大径 4cm、浸润宫颈间质外 1/3 层以及淋巴管血管间隙浸润组成的包含四个中危因素的新模型能精准地筛选复发危险人群 , 指导临床早期宫颈癌根治术后辅助治疗。第二部分 satb1经上皮间质转化促使宫颈癌肿瘤出芽的研究目的研究satb1对宫颈癌肿瘤出芽的影响并探讨相关机制。方法1. 选取2008 年1 月至2012 年12 月根治性手术治疗的figo ib1 期宫颈癌组织制作组织芯片。免疫组织化学染色检测早期宫颈癌组织中satb1表达 , 分析 satb1表达水平与肿瘤出芽个数间的相关性及其对预后的影响。2. 短发夹 rna

6、(shrna)下调宫颈癌细胞株 satb1表达 , 建立稳转细胞株。edu法检测宫颈癌细胞株增殖活性改变 ;transwell 实验检测宫颈癌细胞株侵袭及迁移能力改变。 3. 下调 satb1后:tagman 探针实时荧光定量法及 western blot 检测经典上皮间质转化 (emt)相关因子的mrna水平变化及蛋白水平变化; 罗丹明标记的鬼笔环肽染色检测细胞骨架蛋白改变。 4. 免疫组织化学染色检测宫颈癌组织中emt标志性因子 e-cadherin 的表达 ,spearmans rank 相关分析检测 e-cadherin表达水平与 satb1表达水平间的相关性。 5. 建立裸鼠皮下移植

7、瘤模型 ; 分析 satb1下调后对裸鼠皮下瘤体积、肿瘤出芽及侵袭能力的影响 ; 免疫组织化学染色检测 satb1下调后皮下瘤组织中 e-cadherin 、vimentin及ki-67的表达水平变化。结果1.200例ib1期宫颈癌组织中satb1阴性、弱阳性及强阳性的病例数分别为111(55.5%) 、52(26%)及 37(18.5%) 。随着 satb1表达增强 , 宫颈癌中肿瘤出芽个数明显增多 , 两者呈正相关 (r = 0.505;p<0.01) 。生存分析显示 satb1 阳性组复发及死亡风险更高 (p<0.01) 。2.satb1下调后 ,siha 及 hela 细胞

8、的增殖活性、侵袭及迁移能力均显著下降。 3.stab1下调后 , 多个 emt相关因子 mrna及蛋白水平明显发生改变。其中 ,emt标志性因子 e-cadherin 表达上调 , 转录因子 snail l 及调控细胞结构的因子 vimetin 表达明显下调。4.satb1下调后 , 细胞形态呈现 emt逆向改变 : 由狭长转变为卵圆形 , 呈巢团状分布 ; 胞浆内粗大的应力纤维减少消失, 细胞微丝增多使细胞间粘附性增强。 5. 早期宫颈癌组织内 e-cadherin 表达随着 satb1表达增强而明显减弱 ,spearman 秩相关分析提示 satb1与 e-cadherin 表达呈明显负相关 (r =-0.719,p<0.01) 。6. 体内实验证实 satb1下调后 : 皮下瘤体积显著下降 ; 肿瘤的生长方式由侵袭性生长变为膨胀性生长 , 出芽消失 ;e-cadherin 表达明显下调同时伴随着 vimentin 表达上调 ,ki-67增