兽医实验室作业指导书汇编

1、修订 日期修订单号修订内容摘要页次版次修订审核批准2011/03/30/系统文件新制定4A/0/批准：审核：编制：监测抽样作业指导书一、目的对监测抽样进行有效的质量控制，以确保监测结果的客观性、准 确性、有效性。二、适用范围本程序适用于各种动物的血清学监测抽样和病原学监测抽样。三、职责1. 样品抽样人员应按照本程序进行抽样、封样、编号，同时作好抽样登 记，对样品作适当处理以符合血清学和病原学监测样品的要求。2. 业务接待室负责发放、收回抽样登记表，接收保存样品，并如实作好 接收登记。3. 抽样人员：抽样人员由XX区动物疫病预防控制中心指派，或由 XX区 动物疫病预防控制中心派人监督抽样。抽样人

2、员不得少于两水，对大规模养禽 场应适当增加抽样人员。4. 家禽抽样比例：种禽场按存栏的1 %抽样，规模化养禽场按存栏的 0.5- l %抽样，每个场抽样应不少于50份，散养禽以自然村为单位。5. 家畜抽样比例：种畜场采样比例不应低于 10%规模场不应低于5%散 养家畜按自然村为单位。6. 抽样设备：2-5ml注射器或采血针头、无菌棉签、小青瓶、1.5ml离心 管。7. 抽样单：抽样单格式详见动物疫病监测抽样登记表。抽样时应作好 记录，同时填写一式三份抽样登记表，分别由被检单位、抽样单位及本中 心各保留一份。8. 抽样方式：采用随机数字选样法进行抽样。使用随机数字表，从中 随机选定一个数字作为起

3、点，在该点以后的随机数字中选取有意义的样品编号 的数字作为抽样编号，按此编号抽样。9. 抽样工作流程：9.1抽样人员凭抽样任务单到业务接待室领取动物疫病监测登记表，到指定地点采样。9.2采样后，抽样人员及时对样品进行封样，同时做好抽样登记。抽样登记表一式二份，被检单位存留一份，另一份随样品送中心业务接待室。 贮存和运送：10.1为确保分析样品的稳定性和样品的完整性，抽取的样品由专人妥善 保存，在规定的时间送达业务接待室。10.2样品在冷藏条件下贮存运送。血清未析出时，应静止避免晃动。已污染或溶血的样品不能采用一、目的为确保本中心所适应原始记录规范、详实、溯源性等特点，特制定本作业 指导书。二、

4、适用范围本中心所有的原始记录记载。二、原则1原始记录是实验室管理体系文件的组成部分，是检测活动的见证性文 件，是对已完成的检测工作各环节的真实记载，是出具检测报告的唯一依据。 实验室要真实、完整、准确地记录各项检测活动，渝须编制好一套简洁明了、 方便实用且符合实际检测工作要求的原始记录。2、原始记录主要由现场采样/检测记录、委托检验单、样品接收单、检 测任务单、实验室检测一记录、检验报告底稿等组成。3、原始记录的版面格式包括记录的名称、用途、受控标识、样品编号、 检测、复核、审核的时间和人员、相关信息等内容。粕关信息是检测原始记录 的主体部分，不同类别的检测原始记录其内容也有较大的差别。一般包

5、括样品 的基本信息、检测环境和仪器设备情况、检测相关情况和数据三大部分。3.1样品的基本信息包含受检单位名称、样品名称、数量、性状、采样地 点、保存的条件、送检及采样的时间、检测项目等内容。3.2检测环境和仪器设备情况包括检测时的温度、湿度；使用的主要仪器 设备的名称、型号、编号、检测前后的状态；试剂名称、批号或内部编号等。3.3检测相关情况和数据包括检测的时间、方法及依据，样品处理等，检 测过程中观察到的现象和异常情况的处理，从设备上直接读得的数值或打印记 录等。4、检测原始记录应尽可能地方便检测人员填写。实验室检测记录时，除 经常一起检测的项目可编制多项目的检测记录外，对不经常一起检测的项

6、目应 尽量编制单项目的检测记录。一、目的为确保本中心购进的诊断试剂的质量，应及时进行验收和质量验证，特 制定本作业指导书。二、适用范围：本中心计划购进的所有诊断试剂。三、职责1. 仪器设备室人员负责诊断试剂的验收、记录。2. 检测室人员负责对诊断试剂的质量验证。3. 资料档案管理人员负责相关记录的存档，建立年度对供应商的评价表 和合格服务方名录。四、工作程序1. 诊断试剂的验收：诊断试剂送至中心后，由诊断试剂管理人员进行验 收。诊断试剂管理人员对试剂盒的包装、数量、有效期等内容进行逐一核对， 并填写“供应品验收记录”。诊断试剂应保持包装完好、无破损、试剂在有效 期内、数量符合订货数量。验收合格

7、的诊断试剂按说明书要求进行入库保存。 如发现有破损、超过有效期、数量与订货数量不符等情况，一律按不合格诊断 试剂处置（见3不合格诊断试剂的处置）。2. 诊断试剂的质量验证：诊断试剂入库后，诊断试剂管理人员及时通知 相关检测人员进行诊断试剂的质量验证。对于采购数量大、价格相对便宜的诊 断试剂，如间接血凝试剂、血凝和血凝抑制试剂等，每到一批试剂后，同一批 次随机抽取一盒（套）进行验证试验。对于采购数量少、价格昂贵的诊断试剂, 如PCR ELISA试剂盒等，不单独做质量验证，将第一次检测样品的试验结果作为质量验证的依据。验证试验严格遵照相关程序，由两名检测人员进行，试 验设立阴性、阳性对照，并做好原

8、始记录。如试验对照成立，判为试剂质量合 格；试验对照不成立，判为试剂质量不合格。试验结果及时反馈至诊断试剂管 理人员，验证记录交资料档案室存档。3. 不合格诊断试剂的处置：在诊断试剂的验收和（或）验证过程中发现 不合格诊断试剂时，应及时报中心技术负责人，由技术负责人安排人员与供货 商联系，协调处理，同时填写“不合格供应品处置记录”。4. 记录：应做好诊断试剂的验收、验证等各项工作记录，交资料档案管 理人员存档，资料档案管理人员根据记录建立“供应商评价表”和“合格供应 商名录”。五、记录表格“供应品验收记录”“不合格供应品处置记录”“供应商评价表”“合格供应商名录”移液器自校检查作业指导书一、目

9、的利用空气吸力移取均值、中质密度和中等粘度的液体。二、适用范围不可用于操作与聚丙烯反应或有较高的蒸汽压的液体。三、环境条件温度：20C 士 5C,湿度：50% 士 10%所需仪器和试剂天平，蒸馏水四、操作步骤1、松紧度检验：吸取液体后竖直移液器，停留 10秒钟。如有漏气则会 形成液珠滴下。2、移液：在吸取液体时，将枪头插入液体两至三毫升下，移液器用在第 一档，缓慢吸取液体后停留1秒左右时间，以免空气吸入，注意不要将液体吸 入移液器中。在排除液体时，先将移液键作用在第一档，延容器壁缓慢排除液 体，然后将移液键作用于第二档，将残留体积完全排除。然后顶部的枪头弹出， 排掉枪头。3、称量及计算：调整可

10、调加样器，在加样器最大、最小和中间吸取量上 分别连续吸取五次水，分别称量。通过五次称量计算出平均体积。4、 判定标准：计算出的平均体积同加样器读数比较，误差在 3灿内为合 格。如果超出这一范围，应清洗，维修并重新校正。重新校正仍不合格的，退 回厂家修理或作废弃处理。5、有效期：有效期为一年。如出现故障，需排除故障后再次校订，校订合格方可使用一、口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体检测酶联免疫吸附试验1. 适用范围用于检测猪、牛、羊血清中的口蹄疫病毒 VPI结构蛋白抗体，与猪、牛、 羊口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒联合使用，可区分 口蹄疫病毒感染动物及疫苗免疫动物。检测猪血清应用猪口

11、蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒；检测牛、羊血清应用牛、羊口蹄疫病 毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒。2. 检测试剂口蹄疫病毒VP1抗原包被板、样品稀释液、酶结合物、阴性对照、VP1阳性对照、酶结合物稀释液、TMB底物A液、TMB底物B液、终止液（I.OMHZSQ）、浓缩洗涤液、稀释板、一次性封板膜、微孔定位标签。3. 检测步骤3.1使用前将试剂盒恢复到室温，避免阳光直射或放置在30C 以上的环境中）3.2取出试剂盒中的样品稀释液）A1、B1两孔作为阴性对照，Cl、D1两 孔作为阳性对照孔，其余孔作检测孔，每孔一个样品）3.3在稀释板的各孔中加200样品稀释液

12、。在相应各孔中分别加入 10此 对照血清或被检血清样品。用加样器重复吹吸数次。稀释每个样品时必须使用 不同的吸头）3.4取出抗原包被板）3.5分别从稀释板上取稀释后的对照血清和被检血清各 100此，加至抗原包被板的相应孔中，加益或封膜后，置 37 士 2C下孵育60 士 5分钟。3.6洗涤工作液配制：按需要量，用去产离子水或双蒸水将洗涤液作25倍稀释。3.7用洗涤工作液洗涤抗原包被板，每孔 300吨，洗涤6次，拍干。3.8酶结合物工作液配制：用酶结合物稀释液将酶结合物作100倍稀释，现配现用。3.9每孔加入100此酶结合物工作液，加盖或封膜后，置 372C下孵育302分钟。3.10 重复 3.

13、7。3.1仃MB底物工作液配制：将TMB底物B液和TMB底物A液等量混合，现 配现用。3.12每孔加入100此底物工作液，加盖或封膜后，置 372C 下孵育 151分钟。3.13每孔加入100此终止液，并轻轻振荡混匀。3.14在15分钟内，用酶联读数仪测定在450nln波长下的OD值。结果判定4.1猪口蹄疫病毒vPI结构蛋白抗体检测结果判定：4.1.1阴性对照孔平均0D值应续0.15，每个阳性对照孔0D值应妻0.5 , 且簇2.0。否则，试验无效。临界值=0.23x阳性对照孔平均OD值。4.1.2被检样品孔OD值临界值时、判为阴性，即为抗口蹄疫病毒 VPI结 构蛋白抗体阴性。4.1.3被检样品

14、孔OD值临界值，判为阳性。4.1.4对判定结果为阳性的样品，应用2个孔进行重复检测。重复检测后， 若至少有一个孔为阳性，则判为口蹄疫病毒 VPI结构蛋白抗体阳性，若两孔均为阴性，则判为口蹄疫病毒 VPI结构蛋白抗体阴性。4.1.5当猪口蹄疫病毒vPI结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒与 猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒联合使用时，按下 列标准进行最终判定4.2牛、羊口蹄疫病毒VPI结构蛋白抗体检测结果判定：4.2.1阴性对照孔平均0D直应W 0.2，每个阳性对照孔0D直应0.5，且 2.0。否则，试验无效。临界值=0.23x阳性对照孔平均0D直。4.2.2被检样品孔0D

15、直V临界值时，判为阴性，即为抗口蹄疫病毒 VP1 结构蛋白抗体阴性。4.2.3被检样品孔0D直临界值，判为阳性。4.2.4对判定结果为阳性的样品，应用2个孔进行重复检测。重复检测后， 若至少有一个孔为阳性，则判为口蹄疫病毒 VPI结构蛋白抗体阳性，若两孔均 为阴性，则判为口蹄疫病毒 VP1结构蛋白抗体阴性。4.2.5当牛、羊口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂 盒与牛、羊口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒联合使用 时，按下列标准进行最终判定。一、高致病性禽流感血凝抑制（HI）试验1. 适用范围该试验是目前 WH进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。可用于流感病毒

16、 分离株HA亚型的鉴定，也可用来检测禽血清中是否有与抗原亚型一致的感染 或免疫抗体。HI试验可用来鉴定所有的流感病毒分离株，可用来检测禽血清 中的感染或免疫抗体。2. 检测试剂配置2.1阿氏（Alsevers ）液配制称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水 至100mL散热溶解后调pH值至6.1 , 69kPa 15min高压灭菌，4C保存备用。2.2 10呀口 1%鸟红细胞液的制备2.2.1采血：用注射器吸取阿氏液约1mL取至少2只SPF鸡（如果没有 SPF鸡，可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡），采血约 24mL与阿氏液混合，放入装

17、10mL阿氏液的离心管中混匀。2.2.2 洗涤鸡红细胞：将离心管中的血液经 15001800 r/min 离心8分钟，弃上清液，沉淀物加入阿氏液，轻轻混合，再经15001800 r/min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复 2次以上 过程后，加入阿氏液20 mL轻轻混合成红细胞悬液，4C保存备用，不超过 5天。2.2.3 10%鸟红细胞悬液：取阿氏液保存不超过 5天的红细胞，在锥形刻度离心管中离心15001800 r/min 8分钟，弃去上清液，准确观察刻度离心 管中红细胞体积（mL），加入9倍体积（mL）的生理盐水，用吸管反复吹吸使生理 盐水与红细胞混合均匀。2

18、.2.4 1%鸟红细胞液：取混合均匀的10%鸟红细胞悬液1mL加入9mL生 理盐水，混合均匀即可。3. 检测步骤3.1在微量反应板的1孔12孔均加入0.025mLPBS换滴头。3.2吸取0.025mL病毒悬液（如感染性鸡胚尿囊液）加入第I孑L,混匀。3.3从第1孔吸取0.025mL病毒液加入第2孔，混匀后吸取0.025mL加入 第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025mL弃之，换滴头。3.4每孔再加入0.025mL PBS3.5每孔均加入0.025mL体积分数为1%鸟红细胞悬液（将鸡红细胞悬液 充分摇匀后加入）见附录B。3.6振荡混匀，在室温（2025C）下静置40min后

19、观察结果（如果环境 温度太高，可置4C环境下反应1小时）。对照孔红细胞将呈明显的钮扣状沉 到孔底。3.7将板倾斜，观察血凝板，判读结果（见下表）表1 :血凝试验结果判读标准类别孔底所见结果1红细胞全部凝集，均匀铺于孔底，即100%红细+2胞凝集+3红细胞凝集基本同上，但孔底有大圈+4红细胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝块+5红细胞于孔底形成小圆点，四周有少许凝集块 红细胞于孔底呈小圆点，边缘光滑整齐，即红 细胞完全不凝集能使红细胞完全凝集（100%凝集，+）的抗原最高稀释度为该抗原的血 凝效价，此效价为1个血凝单位（HAU。注意对照孔应呈现完全不凝集（-）， 否则此次检验无效。3.8根据4.

20、1的试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高 稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以 4即为含4HAU勺抗原的稀释倍数。例 如，如果血凝的终点滴度为1:256，则4HAL抗原的稀释倍数应是1:64 （256 除以4）。3.9在微量反应板的1孔11孔加入0.025mL PBS第12孔加入0.05mL PBS3.10吸取0.025mL血清加入第1孔内，充分混匀后吸0.025mL于第2孑L, 依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025mL弃去。3.111孔11孔均加入含4HAU昆匀的病毒抗原液0.025mL,室温（约20C）静置至少30min3.12每孔加入0.025mL体积分数为1%

21、勺鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀， 静置约40min （室温约20C，若环境温度太高可置4C条件下进行），对照红 细胞将呈现钮扣状沉于孔底。4. 结果判定以完全抑制4个HAI抗原的血清最高稀释倍数作为 HI滴度。只有阴性对照孔血清滴度不大于21og2,阳性对照孔血清误差不超过1个 滴度，试验结果才有效。HI价小于或等于21og2判定HI试验阴性；HI价等于 31og2为可疑，需重复试验；HI价大于或等于41og2为阳性。一、猪瘟抗原双抗体夹心ELISA检测方法1. 适用范围本方法通过形成的多克隆抗体-样品-单克隆抗体夹心，并采用辣根过氧化 物酶标记物检测，对外周血白细胞、全血、细胞培养物以及组织样

22、本中的猪瘟 病毒抗原进行检测的一种双抗体夹心 ELISA方法。2. 检测试剂2.1多克隆羊抗血清包被板条8孔X 12条（96孔）2.2CSFV阳性对照，含有防腐剂1.5mL2.3CSFV阴性对照，含有防腐剂1.5mL2.4100倍浓缩辣根过氧化物酶标记物（100X ）辣根过氧化物酶标记抗鼠IgG,含防腐剂200uL2.5 10倍浓缩样品稀释液（10X） 55mL2.6 底物液，TMB/H20溶液12mL2.7 终止液，1MHCL（小心，强酸）12mL2.8 10倍浓缩洗涤液（10X） 125mL2.9 CSFV单克隆抗体，含防腐剂4mL2.10 酶标抗体稀释液15mL3.检测步骤3.1样品制备

23、注意：制备好的样品或组织可以在 27C保存7天，或-20C冷冻保存6 个月以上。但这些样品在应用前应该再次以 1500g离心10分钟或10000g离心 25分钟。3.1外周血白细胞2.1.1 取10mL肝素或EDTA抗凝血样品，1500g离心1520分钟。2.1.2 再用移液器小心吸出血沉棕黄层，加入 500uL样品稀释液 （1X）,在旋涡振荡器上混匀，室温下放置1小时，期间不时旋涡混合。然后直接进行步骤2.1.6操作。2.1.3 假如样品的棕黄层压积细胞体积非常少，那么就用整个细胞团 （包括红细胞）。将细胞加进10mL的离心管，并加入5mL预冷（27C,下同）的0.17M NH4C。混匀，静

24、置10分钟。2.1.4 用冷（27C）超纯水或双蒸水加满离心管，轻轻上下颠倒混匀， 1500g离心5分钟。2.1.5 弃去上清，向细胞团中加入500uL样品稀释液（1X）,用洁净的吸头悬起细胞，在旋涡振荡器上混匀，室温放置1小时。期间不时旋涡混合。2.1.6 1500g离心5分钟,取上清液按操作步骤进行检测。注意：处理好的的样品可以在27C保存7天，或-20C冷冻保存6个月 以上。但这些样品在使用前必须再次离心。3.2 全血（肝素或EDTA抗凝）3.2.1 取25uL 10倍浓缩样品稀释液（10X ）和475uL全血加入微量离 心管，在旋涡振荡器上混匀。3.2.2 室温下孵育1小时，期间不时旋

25、涡混合。此样品可以直接按照“操作步骤”进行检测。或：直接将 75uL全血加入酶标板孔中，再加入10uL 5倍浓缩样品稀释液（5X）O晃动酶标板/板条，使样品混合均匀。再按照“操作步骤”进行检测。2.4 细胞培养物241 移去细胞培养液，收集培养瓶中的细胞加入离心管中。242 2500g离心5分钟，弃上清。243 向细胞团中加入500uL样品稀释液（IX）。旋涡振荡充分混匀， 室温孵育1小时。期间不时旋涡混合。取此样品 75uL按照“操作步骤”进行 检测。2.5 组织最好用新鲜的组织。如果有必要，组织可以在处理前于27C冷藏保存1个月。每只动物检测12种组织，最好选取扁桃体、脾、肠、肠系膜淋巴

26、结或肺。2.5.1 取12g组织用剪刀剪成小碎块（25mn大小）。2.5.2 将组织碎块加入10mL离心管，加入5mL样品稀释液（1X）,旋 涡振荡混匀，室温下孵育121小时，期间不时旋涡混合。2.5.3 1500g离心5分钟，取75uL上清液按照“操作步骤”进行检测。3操作步骤注意：所有试剂在使用前应该恢复至室温 1822C;使用前试剂应在室 温条件下至少放置1小时。3.1 每孔加入25uLCSFV特异性单克隆抗体。此步骤可以用多道加样器 操作。3.2 在相应孔中分别加入75uL阳性对照、阴性对照，各加2孔。注意 更换吸头。3.3 在其余孔中分别加入75uL制备好的样品，注意更换吸头。轻轻拍

27、 打酶标板，使样品混合均匀。3.4 置湿盒中或用胶条密封后室温（1822 C）孵育过夜。也可以孵育4个小时，但是这样会降低检测灵敏度3.5 甩掉孔中液体，用洗涤液（1X）洗涤5次，每次洗涤都要将孔中 的所有液体倒空，用力拍打酶标板，以使所有液体拍出。或者，每孔加入洗涤液250300uL用自动洗板机洗涤5次。注意：洗涤酶标板要仔细。3.6 每孔加入100uL稀释好的辣根过氧化物酶标记物，在湿盒或密圭寸后 置室温孵育1小时。3.7 重复操作步骤3.5 ;每孔加入100uL底物液，在暗处室温孵育10分 钟。第1孔加入底物液开始计时。3.8 每孔加入100uL终止液终止反应。加入终止液的顺序与上述加入

28、底 物液的顺序一致。3.9 在酶标仪上测量样品与对照孔在450nm处的吸光值，或测量在 450nm和620nm双波长的吸光值（空气调零）。3.10 计算每个样品和阳性对照孔的矫正 OD直的平均值（参见“计算方 法”）。4. 计算方法首先计算样品和对照孔的OD平均值，在判定结果之前，所有样品和阳性 对照孔的OD平均值必须进行矫正，矫正的 OD直等于样本或阳性对照值减去阴 性对照值。矫正0口直=样本OD直阴性对照OD直5. 试验有效性判定阳性对照OD平均值应该大于0.500，阴性对照OD平均值应小于阳性对照 平均值的20%，试验结果方能有效。否则，应仔细检查实验操作并进行重测。如果阴性对照的OD直

29、始终很高，将阴性对照在微量离心机中 10000g离心35分钟，重新检测。6. 结果判定被检样品的矫正0D值大于或等于0.300,则为阳性；被检样品的矫正OD直小于0.200，则为阴性；被检样品的矫正OD直大于0.200，小于0.300，则为可疑。二、猪瘟间接ELISA抗体检测1. 适用范围用于检测猪血清中猪瘟抗体。2. 检测试剂2.1包被抗原的微孔板2.2阴、阳性对照血消2.3抗猪IgG-HRP结合物2.4 20倍浓缩洗涤液2.5底物A液、B液2.6终止液2.7样品稀释液3. 检测步骤3.1将试剂盒平衡至室温。3.2将洗涤液用蒸馏水作20倍稀释3.3取预包被的微孔板（根据样品多少，可拆开分次使用），用样品稀释 液将待检样品40倍稀释后加入板孔中，每孔加100uL。阴、阳性对照各设2 孔，每孔100uL。另设一空白对