LPS诱导小鼠急性肺损伤TLR4及TNF―α表达-最新资料

1、LPS诱导小鼠急性肺损伤TLR4及TNF表达-最新资料LPS诱导小鼠急性肺损伤TLR4及TNF表达1.2.1 实验动物及分组 SPF级别的BALB/C雄性小鼠，体重3035 g，随机分成3组，每组10只，A组为正常对照组，不作任何处理；B组为急性肺损伤模型组：腹腔内注射给予LPS（4 mg/kg）腹腔内注射制备ALI模型；C组为抗体组：建造ALI模型前810 h给予TLR4/MD腹腔内注射（50 g）。在建造模型成功后各组小鼠无菌条件下取出肺组织和取小鼠血检测内毒素及TNF-水平，一部分肺组织置于液氮冷冻后，在-80 冰箱保存，为mRNA及蛋白表达的检测，另外部分放置在4%多聚甲醛内固定24

2、h后，HE染色镜下观察小鼠肺组织形态改变。1.2.2 实验指标检测及试验方法 小鼠血内毒素含量检测选用试剂盒（动态浊度法-血浆内毒素检测试剂）的处理方法和步骤，处理血标本，并应用LPS监测分析得出检测数据。 小鼠肺组织HE染色及形态改变 4%多聚甲醛中固定，浸润、经过梯度脱水，透明化处理（二甲醛），石蜡包埋处理，各组切片6张，厚度约7 m，HE染色后，光学显微镜下观察形态及病理变化；损害评分标准应用Gloor等8方法。 小鼠肺组织TLR4基因表达按照TAKALA说明书进行提取总RNA。TLR4基因表达：通过分光光度仪测RNA280 nm/260 nmO

3、D值，立即开始进行逆转录，合成cDNA，引物序列（TLR4），上游5-CCCTGAAAGGCTTGGTCT-3；下游3-GAGGTGTCHHTHHTCTAA-5，扩增产物长度268 bp；引物序列（-actin），上游5-AGGCATACAGGGACAGCA-3；下游3-TACAGCAGGGTCAACCATTG-5，扩增产物长度534 bp。反应体系：10RT Buffer 1 L，MgCl2 2 L，AMV逆转录酶 0.5 L，RNase Inhibitor 0.25 L，Oligo dT 0.5 L，RNase FREE dH2O 3.75 L，dNTP Mixture 1 L，Total

4、 RNA 1 L。反应条件：32 9 min，49.2 32 min，97 4 min，4 4 min。cDNA为模板PCR扩增，反应体系：5PCR Buffer 10 L，MgCl2 2 L，dNTP Mixture 1 L，cDNA 2 L，上下游引物各1 L，H2O 32.75 L，Taq酶 0.25 L；反应条件：96 6 min、（95 30 s、49.2 30 s、72 30 s）33 cycle、72 9 min。 小鼠肺组织TLR4蛋白表达取小鼠肺组织进行总蛋白的提取，提取后用BCA法进行蛋白含量的检测，检测后进行PAGE凝胶电泳，电泳分离60 min后，通过ma

5、ker条带选取约95 kd大小切胶，应用半干转膜方法，封闭60 min，经过一抗、二抗孵育，ECL显色，暗室内曝光，Tannon Gis软件分析测曝光底片光密度值。 小鼠血浆TNF-双抗夹心ELISA检测通过应用ELISA检测TNF-试剂盒方法与流程进行标本处理及检测，并在酶标仪进行检测分析。1.3 统计学处理应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以（xs）表示，各组的均数采取单因素方差分析，组间进行两两比较LSD检验，P B组9 0.98460.0675* C组10 0.30180.0847#*与A组比较，P 7 Liu Z， Yang Z， Fu Y， et al

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7、21（4）：414-420.9 Wang F N， Ma Z Q， Liu Y Z， et al. New phenylethanoid glycosides from the fruits of forsythia suspense（thunb）vahlJ. Molecules，2009，14（3）：1324-1331.10曹荣荣，崔磊.谷氨酰胺对急性肺损伤患者肺部转归的影响研究J.中国医学创新，2013，10（14）：15-16.11 Agorreta J， Garayoa M， Montuenga L M， etal.Effects of acute hypoxia and lipopo

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