酶的抑制及其动力学2次.ppt

1、第十章 酶的抑制及其动力学,第一节 抑制作用及其分类,一 概念: 广义上说，凡是阻碍或降低酶促反应速度的作用称为抑制作用。 1. 钝化或变性作用(inactivation or denaturation) 指酶蛋白受物理或化学因素的影响，部分或全部改变酶的空间构像从而引起酶活性降低甚至丧失的现象。根据除去致变性因素后，酶活性是否可以恢复，变性作用分为可逆和不可逆作用。 特点: 变性后酶蛋白构象发生变化，但肽键不断裂,2 抑制作用(inhibition) 指酶的必需基团受某种化学物质的影响而被改变，导致酶活性降低或失活。 特点: 抑制剂部分或全部接到功能基上或基团 的性质发生改变。但酶蛋白并未变

2、性。 3 去激活作用 加入金属鳌合剂后，去除金属离子结合，使酶活性降低。,二 抑制程度,以反应速度的变化来衡量： 1 相对活力分数 (残余活力分数)： a= ViV0 2 抑制常数(抑制率) ：i =1 - a = 1- ViV0 三 抑制作用的分类： 1. 不可逆抑制: 抑制剂与酶的某些必须基团以共价键形式结合，其抑制剂不能以物理(超滤、透析、电泳)方法除去。 2. 可逆抑制: 抑制剂与酶的某些必须基团以非共价键结合可用物理法除去。,（三）可逆抑制作用与不可逆抑制作用的鉴别 * 物理方法处理：透析，超滤，凝胶过滤； * 动力学方法： 取不同量的酶加到含有等量S和I 的等体积反应体系中，测定反

3、应初速度，以v E作图 将酶与抑制剂预保温后，取不同量混合液加到含有等量S的等体积反应体系中，测定初反应速度，以v E作图,v,v= k2 S E0 Km+ S,v,无,不可逆,可逆,v=k E0,第二节 不可逆抑制作用机理,一 非专一性不可逆抑制剂: 非专一性不可逆抑制剂作用于酶分子中的几类基团 酰化试剂: -SH 磺酰氯 -NH2 D(I)FP + E- -OH 酰化 酸酐类 -酚羟基 烷化剂: 一般含有活泼的卤素基团。 -OH 碘代乙酸 -COOH R-X FDNB + E- -SH 烷化 溴乙酸 -咪唑基 -S-CH3,金属酶抑制剂： 能与金属形成络合物，毒害以金属离子为活性中心的金属

4、酶。如氰化物、硫化物、叠氮化物和CO等 重金属毒物： 重金属盐类，包括Hg、Pb、Ag、Cu等为蛋白沉淀剂；或作用于含 SH的酶 有机汞，有机砷化合物： 作用于酶分子中的Cys巯基，如：路易斯毒气(Lewisite)；解毒(BAL，即二巯基丙醇) 青霉素(Penicillin) ： 作用于糖肽转肽酶(glycopeptide transpeptidase ) 的Ser羟基,氧化剂：包括一些弱氧化剂或光敏剂 过甲酸 -咪唑基 光敏剂 + E- -SH 氧化 四硫硫酸钠 - -OH 还原剂: -S-S- 含-SH化合物 2 -SH 其它修饰剂：重氮化、硝化、酯化等 注意：酰化试剂或烷化剂等一般全部

5、或部分以共价方式结合到酶上；但氧化剂或还原剂是改变或修饰基团的性质。,二 专一性不可逆抑制,(一) Ks型： 是根据底物的化学结构设计的，是酶的底物类似物，可被酶结合但不能被酶作用，分子中含活泼基团，可修饰酶的必需基团。 E + S ES E-I Ks抑制剂的专一性，取决于抑制剂与活性中心必需基团，以及与活性中心之外同类基团形成非共价络合物的解离常数之比： 只有Ks中心/ Ks非中心 10-3 才有应用价值 亲和标记试剂 TLCK（对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲酮，胰酶抑制剂） TPCK（对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮，胰凝乳酶抑制剂),(二) Kcat 型(又称自杀性底物) 根据酶的作用机理设计

6、的，不仅结构和底物类似，且是酶的天然底物，可被酶结合和催化。其中含一个潜伏性基团，由于酶的催化而暴露或活化，从而集中攻击酶的活性中心。又称酶的自杀性底物(Suicidal substrate) E + Si Ks ESi Kcat EI Ki E-I Ks: ESi的解离常数； Kcat： ESi转化为EI的催化常数 抑制作用的关键取决于Kcat，Kcat越高抑制程度高,Kcat型抑制剂比Ks具有更高的专一性： Kcat型抑制剂是酶的底物，不仅被酶结合，而且能被酶催化。可区分具有相同底物，但催化机制不同的酶 Kcat型抑制剂只能形成于酶反应中心，因而专一性攻击酶活性中心基团。 例如某些机磷农药

7、：敌敌畏、敌百虫、乐果等 (RO)2 - P -X O(S),O2N- - O-P OC2H5 肝氧化酶 O2N- - O-P OC2H5 S OC2H5 O OC2H5 (对硫磷) 胆碱酯酶 (对氧磷) Ks O2N- -O- P OC2H5 O OC2H5,（磷酸化胆碱酯酶）,第三节 可逆抑制作用动力学,一 四种基本动力学类型： 1. 竞争性抑制： E + S K1 ES K2 E + P + K-1 I E K1S ES Ki K-i K-1 EI Ki I K-i EI,EI:,E:,ES:,V = k2ES = k2ES E0 = k2 E0 S k-1+k2 (1+ ki I )

8、+ S k1 k-i Vm= k2 E0 Ki = k-iki Km = k-1+k2 k1 V = Vm S = Vm S Km(1+ I ) + S Km+ S Ki 动力学常数的求取： 1 = 1 + Km (1+ I ) 1 V Vm Vm Ki S 相交于纵轴一点，Vm不变；Km增大,I,抑制率： Vm S km(1+I /ki)+ S I /Ki i = 1-a =1 Vi / V0 =1- Vm S = 1+I /ki+S /Km km+ S 若I不变， 抑制率i与S 成反比；若S ， i=0 即：底物量极大时，可解除竞争性抑制 注意: 过渡态类似物：酰苷五磷酸（AP5A) 为腺

9、苷激酶过 渡态底物类似物：ATP+AMP 2ADP 某些竞争性抑制剂并不是底物的结构类似物。如： 水杨酸是NADH为辅酶的脱氢酶或以ATP为底物的肌酸激酶的竞争性抑制剂，但结构与NADH或ATP不同,竞争性抑制的特点：,阻碍底物与游离酶结合，具有竞争关系 竞争性抑制剂可以是底物的基态类似物、过渡态类似物或其它非底物结构类似物。 双倒数作图相交于纵轴一点 Vm不变；Km增大 抑制率i与S 成反比；若S ， i=0,2.非竞争性抑制： E + S K1 ES K2 E + P + K-1 + I I Ki K-i Ki K-i EI + S K1 ESI K-1 特点：底物与抑制剂在与酶结合的过程

10、中互不干扰 四个解离常数 : Ks= K-1 = K-1 =ks K1 K1 Ki= K-i = K-i = Ki Ki Ki,n=4 m=5 用迅速平衡理论：K2K-1 可忽略 ESE + P 则 n=4 m=4,V= K2ES =K2 ES E0 = Vm /(1+I/Ki) S 令Km=Ks Ks + S V= Vm /(1+I/Ki) S Km + S 双倒数图： 1 = 1 (1+I/Ki) + Km (1+ I ) 1 V Vm Vm Ki S 图像相交于横轴一点，Km不变，Vm减小,1/S,-1/Km,1/V,1/Vm,1/Vm,I,抑制率： i= 1 Vi/V0 = 1 1+K

11、i/I 讨论： 非竞争抑制中i 与底物浓度无关，不能通 过增加 S，来解除抑制。 若I升高, 则i增加，若I ， i=100%,非竞争性抑制的特点：,抑制剂可与E或ES复合物结合，底物、抑制剂与酶的结合互不干扰(Ks=KS;Ki=Ki) 双倒数作图相交于横轴一点 Km不变； Vm 减小 抑制率i与S 无关，不能通过增加S来解除抑制。,3 反竞争抑制: E + S K1 ES E2 E + P K-1 + I k-i ki ESI 特点 : 抑制剂只能和酶与底物的复合物结合，而不能单独与酶结合。 V = Vm /(1+I/Ki) S = Vm S Km/(1+I/Ki) + S Km+ S Vm

12、和Km都减少，但 Vm/Km=Vm/Km,动力学常数的求取： 1 = 1 (1+ I /Ki) + Km 1 V Vm Vm S 得到一组平行线 抑制率： i= 1 1+(1+KmS )Ki I 若 I 一定，则 i 与S成正比； 若S，抑制率达到最大, 此时：imax= I /(Ki+ I) S一定，则i 与I 成正比, I ，i=100%,I,反竞争性抑制的特点：,抑制剂只能与ES复合物结合 双倒数作图为一组平行线 Km和Vm 都减小，但减小的比例相同 抑制率i与S 成正比，增加S反而将增强抑制。,4. 混合型抑制： 若S，I 与酶的结合彼此间有一定的干扰， 即KsKs；KiKi，则为混合

13、型抑制。 E + S K1 ES K2 E + P + K-1 + I I Ki K-i Ki K-i EI + S K1 ESI K-1 反应历程和处理方法同非竞争性抑制,Vm和Km都变化,动力学常数求取： 1 = Km 1 (1+ I /Ki ) + 1 (1+ I/Ki) V Vm S Vm 交点坐标：,(KiKm),非竞争+竞争抑制 非竞争+反竞争抑制 I对E的亲和力高于ES I对ES的亲和力高于E,I,混合型抑制的特点：,抑制剂可与E或ES复合物结合，底物、抑制剂与酶的结合并非互不干扰（KsKs; Ki Ki) 双倒数作图相交于第二或第三象限一点， Km、Vm 都减小，但比例不同 抑

14、制率: i= 1-vi/v0 = Km+ S1 +1 (Km/Ki+ S/Ki) /I,四种基本动力学的关系： Ki，竞争性抑制，Km=Km(1+ IKi) Vm = Vm Ki ，反竞争性抑制，Km=Km(1+IKi) Vm= Vm(1+ IKi) Ki=Ki，非竞争性抑制， Km=Km Vm= Vm(1+ IKi) KiKi，Ki Ki 非竞争+反竞争 Ki Ki 非竞争+竞争 混合型抑制是四种基本动力学总方程,二 抑制常数的Ki（Ki）求取:,(一)计算法：双倒数作图 + 计算 加入单一固定浓度的I，测定反应初速度v与S 的关系，双倒数作图得一直线。其斜率或纵截距与无I时的直线之比，除少

15、数外，一般为1+ I/Ki或1+ I/Ki，带入I可求取Ki或Ki。 竞争性抑制：斜率之比=1+ I/Ki；纵截距之比=1 非竞争性抑制：斜率之比=纵截距之比= 1+ I/Ki 反竞争性抑制：斜率之比= 1；纵截距之比= 1+ I/Ki 混合型抑制：斜率之比= 1+ I/Ki； 纵截距之比= 1+ I/Ki 优点：简便快速 缺点：误差较大,(二) Dixon作图法(1/V I):,Dixon作图法： 将S固定在不同的浓度，求每一个S下V0与I的关系，然后以1/V对I作图得一组直线，直线交点的横坐标为Ki值。 设底物浓度为S1时，反应初速度为V1； 底物浓度为 S2时，为V2， 并且S1 S2

16、则各种可逆抑制时的动力学常数求取如下：,竞争性抑制 ：,1 = 1 + Km (1+IKi) 1 V Vm Vm S 1 - 1 = Km (1+IKi) 1 - (1+IKi) 1 V1 V2 Vm S1 S2 若两直线有交点，则应有:1/V1=1/V2 1 - 1 = - I ( 1 - 1 ) S1 S2 Ki S1 S2 I = - Ki 即：交点的横坐标为-Ki,非竞争性抑制： 1 = 1 (1+ I) + Km (1+ I ) 1 V Vm Ki Vm Ki S I= - Ki 反竞争性抑制： 1 = Km 1 + 1 (1+ I ) V Vm S Vm Ki 以Dixon法得到一

17、组平线 所以，无法求得Ki值。, 混合型抑制：,1 = Km 1 (1+ I /Ki ) + 1 (1+ I/Ki) V Vm S Vm 注意： Dixion作图法求取的是Ki值，而不能得到Ki值。,(三) Cornish-Bowden 作图法(S/V I)： 在双倒数方程两侧乘以S，再以S/V I作图，所得直线相交于一点，交点横坐标为-Ki。 反竞争性抑制： 1 = Km 1 + 1 (1+ I ) V Vm S Vm Ki 方程两侧乘以S，得： S = Km + S (1+ I ) V Vm Vm Ki S1 - S2 = S1 (1+ I ) - S2 (1+ I )=0 , I= -

18、Ki V1 V2 Vm Ki Vm Ki,混合型抑制： S = S (1+ I /Ki ) + Km (1+ I/Ki) V Vm Vm 当S1 /V1= S2/V2时， I= - Ki Cornish-Bowden作图法求取的是Ki值.,三 其他类型的可逆抑制:,(一)部分抑制 (partial inhibition): 完全抑制：EI或ESI 为死端产物, I, i=100% 部分抑制：ESI 部分分解 E + I+P, I, i100% 部分反竞争抑制: E + S ES k2 E + P + I ESI k2 E + P +I,k2 k2, 部分非竞争性抑制: E + S Ks ES k2 E + P + + I I Ki Ks Ki EI + S ESI k2 E + P +I 部分混合型抑制 ： k2 k2 Ks Ks Ki Ki 部分竞争性抑制 ： 有少量ESI形成，但k2 =k2 ,Ki Ki ,Ks Ks 当S 可减缓抑制，Vm不变， Km增大,Ki =Ki Ks =Ks k2 k2,部分抑制的公式推导： Ki = k-i / ki = ES I ESI = ES I ESI Ki V = k2 ES+k2 ESI = k2 ES(1+ k2 I ) k2 Ki Vm ( 1+ k2 I / k2Ki ) S = 1+ I / Ki K