植物细胞工程课件资料

1、绪论第一节 细胞工程在生物技术领域中的地位一、生物技术( biotechnology )：利用生物学过程解决人类生存和发展所面临的问题。 内涵：运用现代生物学理论与科学技术改造细胞的遗传物质，培育出人们需要的 生物新品种；工业规模地利用现有生物体系，制备生物产品；模拟生物体系，以生物化学工程 代替化学工程，制备工业产品；发展相应的科学理论与工程技术。包括基因工程、细胞工程、 酶工程、发酵工程、生化过程。二、细胞工程概念及范畴细胞工程 (cell engineering) ：应用细胞生物学和分子生物学方法， 借助工程学的实验方法或技术， 在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的

2、细胞、细胞产品或新生物体 的有关理论和技术方法的学科。广义：所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术。 狭义：细胞融合和细胞培养技术。三、与其它相关课程关系1、理论基础：细胞生物学、分子生物学、生物化学。2、细胞工程提供了新的实验体系 细胞融合、核移植技术(将一个细胞的细胞核转移到另一个去核细胞中的操作。常用于研究核 质关系和克隆动物) ：定向改造生物遗传性状 植物离体培养技术优势：人工控制、缩短研究周期3、与其它技术相结合四、细胞工程在现代生物技术中的地位及实践意义1、改善农业生产技术 利用有限的农业资源养活更多的人口2、保护自然资源，维护生态平衡 生物农药是指利用生物活体(真菌，细菌，

3、昆虫病毒，转基因生物，天敌等)或其代谢产 物(信息素，生长素，萘乙酸， 2， 4-D 等)针对农业有害生物进行杀灭或抑制的制剂。3、生物医药开发第二节 植物细胞工程发展 植物细胞工程：以植物组织细胞为基本单位，在离体条件下进行培养、繁殖或人为地精细操作， 使细胞的某些生物学特性按人们意愿发生改变，从而改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物 个体，或获得有用物质的过程。 利用离体培养细胞进行遗传操作，实现植物品种改良的生物技术。 安全的，绿色的技术：不涉及重组 DNA 和有害外源基因的导入。1、探索阶段 细胞学说：1839， Schwann “如果具有与有机体内一样的条件，每个细胞应该可以独立生活

4、和发展 细胞全能性学说：1902， Haberlandt 植物细胞离体培养实验2、培养技术建立阶段一是培养基模式 二是激素调控模式 幼胚培养和胚胎拯救( embryo rescue)： 最先应用的植物细胞工程技术B 族维生素的应用： White 等腺嘌呤的发现：Skoog和Tsui （崔徵）激动素的发现： Miller 单个胡萝卜细胞形成体细胞胚：1958， Steward3、应用研究阶段 茎尖培养与脱病毒快速繁殖中国罗士韦最早研究茎尖培养Morel and Martin 将茎尖培养应用于脱毒 形成最早的植物细胞工程产业单倍体技术，三倍体育种，原生质体培养和 体细胞杂交 中国学者均做出重要贡献

5、应用研究阶段 ?体细胞无性系变异：高蛋白小麦、高赖氨酸玉米、耐盐小麦等 ?植物细胞大量培养生产有用的次生代谢产物：紫草素、紫杉醇等 ?离体受精与合子培养二、我国植物细胞工程的研究进展花药培养和单倍体育种：朱至清N6培养基植物脱毒和快繁技术 原生质体培养技术 人工种子 次生代谢物生产第三节 植物细胞工程技术类别及应用一、类别：不同培养层次、不同工程技术策略二、应用1、育种上应用 2、种苗脱毒与快繁 3、次生代谢物生产 植物细胞工程技术在育种上的应用?1、快速获得特殊倍性材料：单倍体、三倍体2、克服远缘杂交不亲和性3、克服杂种胚早期夭折 4、导入外源基因5、突变体筛选6、种质资源保存细胞学说：细胞

6、是生物结构、功能和发育的基本单位胡克 施莱登 施旺 染色体及分裂行为的发现：strassburger Hertwig Flemming Boveri 孟德尔遗传定律细胞全能性学说：Haberlandt， 1902细胞有可能在离体培养条件下分裂分化，形成胚胎和植株第一节 胚性细胞 植物的干细胞 胚性细胞或分化程度不高的细胞才具备发育为胚胎和植株的全能性 早期胚胎细胞 顶端分生细胞 成熟组织中遗留的胚性细胞 （能够产生不定胚或不定芽的体细胞） 茎端和根端分生细胞第二节 从分化细胞到胚性细胞 植物的胚胎干细胞：茎端分生细胞、形成层分生细胞和薄壁细胞 组织干细胞：分化程度高的一些细胞脱分化（ dedi

7、fferentiation）: 分化细胞转变为分生状态，形成胚性细胞团或愈伤组织的现象。 脱分化条件：创伤和外源激素第一章引子 细胞全能性学说第一节 细胞全能性及其表达 细胞工程的核心是在培养条件下调控细胞全能性表达 一、细胞全能性1839, Schwann：低等植物的任何细胞均能从植物体分离并继续生长。细胞全能性( cell totipotency )：一个生活细胞所具有的产生完整生物个体的潜在能力。 动植物细胞都有全能性。细胞全能性学说：作为高等植物器官和组织基本单位的细胞，有可能在离体培养条件下实现分 裂和分化，乃至形成胚胎和植株。不同细胞全能性差异 理论上，任何一个生活细胞都有全能性，

8、但要首先回复到分生状态或胚性细胞状态。不同细胞 回复能力不同。合子及早期胚胎细胞均为胚性细胞。 植物胚胎干细胞：植物顶端分生组织细胞具有较强表达全能性能力。 完全失去分裂能力的细胞，如细胞核开始解体的筛管和木质部部分不能回复全能性。* 三类植物细胞：?茎尖、根尖、形成层细胞 周期细胞 ?导管、筛管、气孔保卫细胞等特化细胞，终端分化细胞。 ?表皮细胞及各种薄壁细胞。受外界刺激后可重新启动分裂，称为G0 细胞。“生理脱离 ”效应： in vivo, 细胞全能性不表达； in vitro ，可再生。 外在调控：细胞的脱分化和再分化。细胞或组织的离体培养技术就是细胞脱分化和再分化的控制过程。 全能性表

9、达的基本前提：与母体的分离、激素的调控二、培养条件下的细胞脱分化脱分化是细胞全能性表达的前提再分化是细胞全能性表达的最终体现脱分化( dedifferentiation) ：培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生 细胞状态的过程。* 细胞脱分化过程中的生理活动与细胞结构变化： 细胞质显著变浓，大液泡消失 核体积增加并逐渐移位至细胞中央 细胞器增加其中细胞脱分化的重要特征：液泡蛋白体的出现，质体转变为原质体。 细胞开始脱分化的标志：蛋白体的出现，同时细胞质密度增加。* 细胞脱分化的 3 个阶段1 、启动阶段：细胞质增生，开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白体出现2、演变阶段：细胞

10、核向中央移动，质体转变为原质体3、脱分化终结期：回复到分生细胞状态，细胞分裂即将开始。* 激素的作用 ?激素是离体培养的必须条件，与植物激素相关的基因表达是启动细胞脱分化的关键。 ?激素并不直接作用于 DNA 而导致特定基因的激活，而是需要受体蛋白及其它信号转导过程的 参与。?生长素感应： 植物细胞感受生长素的信号时通过生长素受体和生长素分子相结合，使生长素受体被活化来完成。* 细胞分裂与愈伤组织形成?多数情况下， 细胞脱分化后进入细胞分裂的结果是形成愈伤组织，但不是脱分化必然形成愈伤组织。?愈伤组织内细胞并不均一。 ?脱分化是细胞生理状态的改变，形成愈伤组织是离体培养中的一个阶段。三、细胞分

11、化?细胞分化( differentiation )：导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过 程。?再分化( redifferentiation )：离体条件下，细胞脱分化后，无序生长的细胞及其愈伤组织重新进 入有序生长再生为个体的过程。再分化过程事实是基因选择性表达与修饰的人工调控过程。?管家基因(house keeping gene)：维持细胞最低生命活动的基因，如组蛋白基因?奢侈基因(luxury gene):与细胞行使特殊功能有关的基因，常在一定条件下大量表达。?细胞分化从基因调控水平上来说即是奢侈基因选择性表达的结果。* 极性与细胞分化：?极性( polarity )

12、：植物细胞分化中一个基本现象。?细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志。?极性生长的重要原因：细胞内不同方向Ca+梯度分布。* 激素在细胞分化中的作用 :?生长素能刺激木质部的发生。?生长素和细胞分裂素对于细胞生长和分化具有协同作用，不同的量比配合对细胞分化有重要的调节作用。?内源激素水平的差异使得对外源激素的反应不同。?先生长素后分裂素，利于细胞分裂；反之，利于分化。* 植物细胞离体培养再生两条途径 :1、器官发生( organogenesis)2、体细胞胚胎发生( somatic embryogenesis)第二节 器官发生植物的离体器官发生：培养条件下的组织或细胞团(愈伤组织)分化形成不定

13、根(adventitiousroots)、不定芽(adventitious shoots)等器官的过程。一、离体培养中器官发生的方式?1、先芽后根，较为普遍。2、先根后芽。?3、愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株。二、愈伤组织离体再分化器官的3 个生长阶段1、外植体经诱导形成愈伤组织。愈伤组织 callus calli 一团无序生长的细胞2、“生长中心 ”形成：拟分生组织，细胞小，细胞质稠密，蛋白质合成丰富，液泡逐渐消失。由 无序到有序。3、器官原基及器官形成。* 不经过愈伤组织形成器官原基的 2 种情况1、外植体中已存在器官原基，如茎尖、根尖分生组织培养2、外植体

14、某些部位细胞，重新分裂后直接形成分生细胞团，形成器官原基。三、起始材料对器官分化的影响1、母体植株的遗传基础:被子植物比裸子植物容易2、外植体类型 :生理状态年轻，来源于生长活跃或生长潜力大的组织器官的细胞更易培养。四、激素对器官分化的调控?IAA 与 KT 比例高时利于根的形成，低时利于芽的形成?植物多肽 PSK 可极大加强基本激素的作用效果。* 激素的活化形式和钝化形式 ?细胞分裂素自由碱基形式是活性形式，核苷形式为钝化形式。 ?生长素，游离态具有诱导和调控作用，与氨基酸等的复合体形式是钝化形式。* 光照对器官发生的影响 ?诱导中暗培养或弱的散射光利于愈伤组织形成。 ?分化阶段一般每天光照

15、1416h。?连续光照利于维管束形成 ?昼夜光照周期利于极性建立和形态发生。第三节 体细胞胚发生体细胞胚 somatic embryo (胚状体 embryoid )：离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚 胎发育过程所形成的胚的类似物。1、离体培养2、起源于非合子细胞3、有胚胎发育过程，不同于器官发生途径 一、体细胞胚的形成1、从外植体上直接发生2、经过愈伤组织： 诱导形成愈伤组织；胚性化；体细胞胚形成。高浓度 2,4-D 可诱导愈伤组织产生； 转到低浓度使胚性化。3、细胞悬浮培养的体细胞胚发生 胚性细胞团：成簇成团的体积小而细胞质致密的细胞。* 好的细胞系的获得途径1、液体培养基中建立细胞

16、悬浮系2、固体培养基诱导胚性愈伤组织，再悬浮培养。* 体细胞胚的结构与发育特点 ?体细胞胚发育成再生植株有两个特点：1、双极性 ( double polarity )2、生理隔离：体细胞形成后与母体的维管束系统联系较少。* 体细胞胚与合子胚的不同 ?合子胚发育初期有明显的胚柄，体细胞胚只有类似胚柄的结构。?子叶不规范体积小 干物质含量低含水量高没有休眠* 影响体细胞胚发生的因素1、外源激素的调控2,4- D 应用最为广泛。一般单子叶使用浓度高于双子叶。一般形成球形胚后除去生长素利于胚的继续发育。 分裂素对于维持根和茎分生组织的生长发育有重要作用。常用 BA 。体细胞胚诱导中， 分裂素浓度一般低

17、于生长素。2、培养基及条件的影响 体细胞胚发生要求培养基含有一定浓度 的还原态氮。 球形胚形成后，降低无机盐浓度可显著促进体细胞胚的进一步发育。3、不同基因型间差异 自然条件下容易产生无融合生殖胚的植物易获得体细胞胚。四、体细胞胚发生的生化基础1、内源生长素的变化 外源通过内源起作用。 外源 2,4-D 效果好：细胞内高浓度的游离形式，对内源激素没有反馈抑制。2、特异蛋白质 胚性愈伤组织的水溶性和盐溶性蛋白高，非胚性的醇溶性蛋白高。第二章 离体培养下的遗传与变异 体细胞无性系变异( Somaclonal variation )：经过组织培养循环出现的再生植株变异。 体细胞无性系变异是普遍现象，

18、组织培养是诱导的主要原因。1、体细胞再生植株的变异2、花粉植株的无性系变异* 随机性变异和人为创造变异 随机性变异：体细胞培养过程中产生的 人为创造变异：体细胞人工突变、基因转移、体细胞融合 具有目的性和方向性 物理诱变(紫外线、 X 射线等)和化学诱变( DES、 EMS 等)第一节 离体培养中的遗传与变异特点嵌合体 (mosaic) ：同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞 外遗传变异：不涉及基因结构的变化，只是在基因表达水平上的差异，是细胞内原有遗传潜力 在离体培养中诱导表达的结果。如最常见的生长素自养型变异。 生理适应性变异：在某种外界条件存在时才表现出变异。* 体细胞无性系变异的特

19、点1、体细胞无性系变异是组培中较普遍现象2、体细胞无性系变异可遗传 3、体细胞无性系变异频率显著高于自然突变 4、体细胞无性系变异与外植体来源及培养时间有关* 影响无性系变异频率的因素1、外植体的来源 不同物种、不同品种、不同器官的外植体对无性系变异率都有影响。 分化水平高的组织产生的无性系比分生组织产生的更易变异。 2、外源激素：激素对多倍体的诱导在各种植物中有所不同3、继代培养时间：愈伤培养时间延长会使培养细胞中染色体数目变异范围增加4、再生植株方式：体细胞胚胎发生形成的植株也存在无性系变异5、外植体细胞中预先存在的变异* 其它一些规律1、二倍体细胞较单倍体细胞稳定2、变异率随树龄增加而增

20、高 3、高浓度生长素促进二倍体细胞分裂，低浓度促进多倍体细胞分裂4、悬浮培养的细胞易产生变异 5、原生质体细胞培养更易产生变异 6、性细胞再生植株更易变异* 获得较高频率的体细胞无性系变异 以分化程度高的组织或细胞为外植体，在一定植物激素浓度下诱导愈伤，并经较 长时间的继代培养，然后诱导分化再生植株，有可能得到较高频率的体细胞无性系变异。第二节 体细胞变异的细胞遗传学基础1、染色体数目和结构变异非整倍体 染色体断裂、缺失、易位、基因重复和突变 植物组织和细胞进入离体培养环境后，细胞分裂的不规则性显著增加，导致染色体和分子水平 的变异。最常见是染色体数目变化。* 染色体结构变异 结构变异根本原因

21、在于染色体断裂，断裂会造成染色体缺失及重接后重复、倒位、易位。 在农作物和近缘属的远缘杂种中异源染色体之间的易位系利用价值最大，因为可以引入有用的 外源基因。离体培养细胞染色体易于断裂原因：细胞离体培养时分裂周期缩短，分裂速度加快，异染色质 复制落后于真染色质，形成染色体桥，造成染色体断裂。2、离体培养细胞异常有丝分裂类型 培养细胞染色体数目变化由异常有丝分裂产生，异常有丝分裂有以下类型：1、有丝分裂失败或进行无丝分裂2、核内有丝分裂( endomitosis) ：染色体复制而细胞不分裂3、核内再复制 ( endoreduplication )：DNA 复制而染色体不复制 4、有丝分裂时形成多

22、极纺锤体第三节 体细胞变异的分子遗传学基础 11、 DNA 总量的变异(扩增与丢失) ：组培中 DNA 重复序列有显著的选择性扩增 2、核基因突变(碱基突变) ：点突变是引起无性系变异的原因之一 诱发突变和无性系变异中均存在大量单基因突变，但诱发突变多是隐性基因突变，而无性系变 异中，显性变异频率也很高。无性系变异经常出现一个或少数基因的突变，即所谓 “微变异 ”，特别适合于不改变品种基本特 性而改变个别特性，这是杂交育种，甚至诱变育种都做不到的。3、细胞质基因突变4、转座因子(transposible elements)的活化转座子根据转座机理可分两类，转座子(tran spos on s)

23、和逆转座子 ( retrotransposons ) 。两类转座子在组培中能被激活，发生转座和插入，引起变异。转座子活化可解释无性系变异的一些特点： 转座子活化可造成基因表达的广泛变化，因此无性系变异频率才如此之高 转座子具有使不活动的结构基因活化特点，因此会有显性基因 转座子还可使多拷贝基因中那些不表达的拷贝活化，提高基因表达的强度，即基因放大。5、DNA 甲基化通过 DNA 甲基化和去甲基化调控基因的表达与关闭，适应环境对生物体的压力。* 无性系变异在育种上的应用1、在田间从再生植株中选择有用的细胞突变体 体细胞无性系变异适于对现有品种进行有限的修饰与改良2、利用选择压选择有用细胞突变体

24、在愈伤培养阶段向培养基加入选择压，选择有用的抗性细胞系，经再生获得抗性突变植株。3、利用体细胞无性系变异获得易位系 : 利用远缘杂种体细胞培养物的无性系变异获得易位系 利用远缘杂种花药培养的无性变异系获得易位系* 利用选择压选择有用细胞突变体1、对氨基酸和氨基酸类似物抗性的选择有可能得到必需氨基酸含量高的细胞突变体: 氨基酸类似物在氨基酸生物合成中可起假反馈抑制剂作用，或被组入蛋白使酶功能失活。加入相应的天然氨基酸可解除对生长的抑制，可能由 于反馈敏感性的改变而导致天然氨基酸过量生产，过量生产的氨基酸可被排入培养基中。2、 抗病细胞突变体的筛选 3、抗除草剂细胞突变体的筛选 4、抗逆细胞突变体

25、的筛选 : 抗盐 细胞系及植株 , 聚乙二醇作为筛选剂获得耐旱植株 , 低温作为筛选剂获得耐旱植株 , 重金属离子为筛选剂得到多种突变体5、单倍体细胞突变体的筛选 : 利用单倍体培养细胞的无性系变异筛选抗性突变细胞株具有高效和容易稳定两大优越性：隐性突变基因可以表达，大大提高选出抗 性细胞株的机率；显著加快了突变体的稳定和纯合过程。第三章 植物细胞培养技术原理实验室及设备培养基制备室 : 烘箱 冰箱 天平 灭菌锅无菌操作室 : 超净工作台（生物安全柜）培养室 : 光照培养室暗培养室 摇床显微工作室 : 倒置显微镜* 器皿的选择与清洗清洗：自来水洗，烘干 泡酸 自来水洗 去离子水洗 三蒸水洗 烘

26、干 新瓶子均按该程序清洗，培养材料染菌的瓶子经高压灭菌后也按该程序清洗。酸液（洗液） ：浓硫酸加重铬酸钾* 培养基母液的配制 1基本培养基：不含激素的培养基母液：浓缩液大量元素母液：通常配成10X浓缩液，配1L培养基时加100mL注意：配制时加一个溶解一个，最后加钙微量元素母液：通常配成1000 X浓缩液，配1L培养基时加1mL铁盐母液：通常配成 100 X浓缩液，配1L培养基时加10mL螯合铁使得培养基 pH升高至68时，铁离子仍保持二价，可被很好地吸收利用* 培养基母液的配制 2有机物母液（维生素与氨基酸）：通常配成100 X浓缩液，配1L培养基时加10mL植物激素母液：通常配成0.1mg

27、/mL浓缩液，配1L培养基时加x mL常用生长素：2,4-D, NAA 配制时先用少量 0.1mol/L NaOH溶解常用细胞分裂素：6-BA, KT配制时先用少量 1mol/L HCl溶解注：母液配好后，注明名称、浓度、配制时间，4C冰箱保存培养基的配制程序1 、按照配方，精密量取准确体积的大量元素、微量元素、铁盐、有机物、激素母液于干净烧杯中2、加入蔗糖（通常用量 30g/L），溶解定容。3、 调 pH=5.8NaOH 和 HCL 调如果是固体培养基，在调好 pH 后加入琼脂（通常用量 7g/L） ，加热溶解后分装。4、分装，封口，标记。5、高压灭菌：115 C, 15min。*8 过滤消

28、毒 :高压灭菌会破坏活性，有些物质需要进行过滤消毒加入到培养基：0.45或0.22卩m微孔滤膜进行过滤。如激素、诱导子等。* 材料器械的消毒与无菌操作植物材料的消毒在充分清洗后（通常流水冲洗几小时） ，复合灭菌： 75酒精灭菌 0.5min ， 0.1%升 汞灭菌520min。消毒效果非常好。消毒剂灭菌后一定要用无菌水充分清洗。器械的消毒玻璃器具高温灭菌：121C， 30min ； 塑料枪头、枪头盒子、滤膜等：115C， 15min灭菌后烘箱内烘干；75 酒精消毒后拿入安全柜，部分进行火焰灭菌。* 灭菌 sterilization 方法1、高压灭菌 2 、干热灭菌 3 、过滤灭菌 4 、药剂灭

29、菌 5 、火焰灭菌6、熏蒸灭菌：KMnO4+HCH实验室灭菌7、紫外灭菌：无菌间及安全柜灭菌* 细胞计数 细胞鲜重和干重减压抽滤后测得细胞鲜重（FCV）,烘箱内烘至恒重，测得细胞干重（DCVV有丝分裂指数一个细胞群体中， 处于有丝分裂的细胞占总细胞的百分数。 衡量同步分裂的最好指标。植板率：平板法培养单细胞或原生质体时，细胞形成细胞团的频率=（平板上的细胞团数/平板上接种的细胞数）X 100* 植物激素调控 离体细胞的器官与胚胎发生 Plant hormones Plant growth regulators 激素的合理运用是植物细胞工程研究重要的基本方法：器官分化和植株再生；获得最大细胞生

30、物量和次生代谢物产量* 生长素和细胞分裂素 生长素：组培中生长素添加为了促进离体细胞分裂形成愈伤组织，或诱导试管苗生根 强度： 2,4-D 、 NAA、 IAA 的强度比 100:10:12,4- D： 2,4-dichloro phenoxyacetic acid2,4- 二氯苯氧乙酸细胞分裂素：组培中分裂素添加能诱导离体培养的芽形成丛生芽，诱导离体组织的细胞增殖， 再生不定芽。激动素（ KT, kinetin ）人工合成 ;6-BA （6-Benzyladenine）赤霉素：组培中GA3用于诱导离体芽的萌动和伸长乙烯 : 最普遍的功能是加速果实的成熟和组织的老化。乙烯对组织培养物的生长、胚

31、胎发生或 芽的形成产生抑制作用，因此通过降低培养基中蔗糖的浓度，或用麦芽糖和葡萄糖代替蔗糖来 抑制乙烯的产生。脱落酸 ： 组培中主要用于胚胎或胚状体发育的后期，抑制胚胎的过早萌发，促进胚胎成熟，使 胚胎长成形态正常的植株生长素和细胞分裂素的协同作用 ： 较高浓度的生长素单独或与细胞分裂素结合使用可有效刺激 培养细胞的增殖和连续生长，形成愈伤组织。培养基中 KT 浓度高于 IAA 浓度时，培养物形成芽，不形成根；两者浓度大致相等时，只诱导 愈伤组织发生，基本没有器官发生；当 IAA 浓度高于 KT 时，培养物分化出根，不形成芽。 这种KT和IAA浓度比例效应，适合于许多双子叶植物的组培。其它类生

32、长素和分裂素结合使用， 效应相类似。但并非绝对。禾谷类植物的情况有所不同2,4- D 或 2,4,5-T 单独作用即可诱导禾谷类植物的幼嫩组织（幼胚和幼穗）产生愈伤。其愈伤 在低浓度生长素单独作用下，即可实现离体器官发生或胚胎发生，细胞分裂素并非必需。* 激素和其它化合物对体细胞胚胎发生的影响体细胞胚胎发生（ somatic embryogenesis）： 从植物体细胞培养物中分化胚胎或胚状体的过 程。体细胞胚胎发生和离体器官（芽和根）发生是两个不同的发育过程。 体细胞胚胎发生不一定需要外源激素诱导。但大多数情况下，需先利用生长素和细胞分裂素 先诱导外植体形成愈伤，然后转到无激素或低浓度生长素

33、的培养基上诱导体细胞胚胎发生。只有 2,4-D 与体细胞胚胎发生有必然联系。 许多含氮化合物，如高浓度的氨态氮、谷氨酰胺、天门冬酰胺、脯氨酸和蛋白水解物等，往 往对体细胞胚胎发生有促进作用。第四章 植物组织和器官培养第一节 植物脱毒与快速繁殖快繁( rapid propagation )或微繁 ( micropropagation )技术： 利用组培进行快速营养繁殖的技术。 快繁的应用：1、杂合植物材料的大量繁殖。 2、脱毒种苗生产 3、加速繁殖数量有限的特殊种质材料4、单独繁殖雄株或雌株* 快繁的发展史 120 世纪 40 年代，中国罗士韦世界上最早研究茎尖培养，之后Ball 由茎尖获得植株

34、1952， Morel 和 Martin 通过茎尖培养获得无病毒大丽花1960， Morel 获得无病毒兰花此后在欧美国家出现以茎尖培养为基础的兰花、 马铃薯和草莓等植物的脱毒试管苗 工厂，形成最早的植物细胞工程产业。* 快繁的发展史 2 我国脱毒快繁产业： 20世纪70年代，罗士韦和崔瀓，率先开展经济植物脱毒茎尖培养研究。中科院植物所陶国清、陈维伦分别建立了马铃薯和苹果的茎尖培养技术中科院上海植物生理研究所王熊等开展了兰花和无籽西瓜的快繁研究，并建立了甘蔗 的组织育苗技术。一、 植物快繁的途径与方法技术 利用芽和茎尖培养进行快繁选取只带12个叶原基的生长点进行脱毒。双子叶植物常用 MS培养基

35、，单子叶植物常用B5培养基。经验：大量元素减半， 不加肌醇并将 VB1 提高至 1mg/L 的 1/2MS 适合于大多数植物的茎WPM (Wood Plant Medium )：专为木本植物茎尖培养设计* 激素的使用细胞分裂素： 打破芽的休眠和克服顶端优势， 促使形成丛生芽。 最常用 6-BA ， KT 等， 0.52mg/L 。 生长素：低浓度，促进芽生长。 IAA 、 NAA 、 IBA 等， 0.11mg/L。 赤霉素：低浓度，促进芽伸长。光照有利于大多数植物茎尖培养和芽的分化与增殖。 但块茎和鳞茎的分化和增殖需要黑暗条件。* 外植体褐变褐变原因 :植物中含有多酚，创伤会激活多酚氧化酶，

36、将多酚氧化为棕褐色的醌类，使得外植体 切口发生褐变，并渗透入培养基，严重影响培养物的生长和分化，甚至致其死亡。 影响褐变因素：木本植物外植体易褐化，尤其成年树；培养基中过高浓度的无机盐和肌醇会加 剧褐变； 6-BA 和 KT 有诱导褐化作用；强光和高温会促进褐化。* 外植体褐变防治1、选取酚类含量低的实验材料2、选择无机盐含量低，不加肌醇的培养基3、在弱光线或黑暗条件下培养4、培养基中加入抗氧化剂：Vc、柠檬酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇和聚乙烯吡咯烷酮( PVP) 。 5、在培养基中加入 0.5%1%活性炭，吸附醌类，注意同时提高培养基中激素浓度。6、不断地更换新培养基* 腋芽的生长与增殖 一般使

37、用细胞分裂素打破顶端优势， 促使腋芽萌动。 顶端优势不被细胞分裂素打破的植物， 如葡萄，可用切段法繁殖。腋芽增殖的最大优点：培养物不易变异，可长时间大量提供遗传同质的试管苗低温处理有时有促进腋芽萌动和增殖作用* 诱导生根有些植物在无激素基本培养基上即可生根木本植物则在生根培养基上才能生根，常用生长素：NAA IBA IAA ，0.110mg/L经验： 1/2 MS、 White 、 WPM 、 Anderson 培养基可用于试管苗生根。铵态氮含量低的 N6、B5 利于生根。蔗糖浓度降低，可促进试管苗自养。 移栽试管苗先在强光和较低温度下生长一段时间，根刚长出时移栽最合适。 先在温室过渡培养。利

38、用植株再生技术进行快繁* 再生植株方式 3 种：1、外植体直接产生不定芽2、外植体产生愈伤，转移培养后产生胚状体，再生植株3、外植体产生愈伤，转移培养后分化芽，再生植株。外植体直接产生不定芽 不定芽：顶芽和腋芽以外任何其它器官或组织产生的芽 不定芽形成的个体形态和遗传相同。* 愈伤组织产生胚状体诱导胚状体形成时，一般使用胚、分生组织和花药组织作为外植体。先诱导外植体轻微的 愈伤化，再转移到胚状体诱导培养基上。双子叶植物：MS适合单子叶，尤其禾谷类：附加14002000mg/L脯氨酸的N6基本培养基比较理想。 2,4-D非常重要：高浓度诱导愈伤， 低浓度(或不加)诱导胚状体。优点：繁殖系数高，双

39、极性，无需生根。控制好胚状体发生和生长的同步性，诱导休眠，制造 人工种子是最理想的快繁方法。缺点：会有少量变异株* 愈伤组织分化芽和植株 最严重问题：细胞在遗传上的不稳定性，再生植株较高频率的无性系变异 另一缺点：随着继代，植株再生能力下降直至丧失。尽量避免这种方法。二、 组培脱毒快繁技术 茎尖脱毒原理：病毒通过植物的维管束和细胞壁上的胞间连丝扩散到所有的组织和器官，但植 物茎尖分生组织由分生细胞构成，分生区域内无维管束，细胞壁的胞间连丝也不发达，病毒很 难进入，所以生长点往往不含病毒或含极少量病毒，因此采用茎尖可进行脱毒快繁。* 茎尖培养脱毒技术一般选取带 12个叶原基的顶端分生组织培养。

40、生长素一般采用 NAA 或 IAA ，应避免采 用使茎尖愈伤组织化的 2,4-D 无病毒苗只是相对：无特定病毒种苗或无特定病原菌种苗* 高温和低温处理脱毒技术 高温脱毒：病毒和植物细胞对高温耐受力不同。热处理脱毒又称为温热疗法(thermotherapy),分温汤浸渍处理和热风处理两种。 茎尖培养结合热风处理可取得较理想的脱毒效果。低温脱毒也称冷冻法( cryotherapy)化学处理脱毒2-硫尿嘧啶、 8-氮鸟嘌呤、 virazole 和一些蛋白质与核酸合成的抑制剂，能不同程度地抑制病毒 复制，处理离体培养的组织、细胞或原生质体有相当好的结果。* 植物病毒的鉴定 病毒鉴定的必要性：由茎尖或愈

41、伤分化的植株并不都是无病毒的，在培养中许多病毒有逐渐恢 复的特点，所以最初 10个月，要定期重复进行病毒的鉴定。另外无毒植株仍可能染毒，要进行 抽查。植物病毒鉴定方法 11、指示植物法：利用病毒在已感病的指示植物上出现症状的特征作为鉴别病毒的依据。1920 Holmes 首创2、抗血清鉴定法植物病毒是由核酸与蛋白组成的核蛋白，是一种抗原，注射到动物体内即产生抗体。抗体存在于血清中即为抗血清（antiserum）。这是目前快速定量测定病毒的常规诊断方法。3、酶联免疫法ELISA enzyme linked immunosorbent assay 将抗原固定在支持物上，加入待检血清，然后加入 酶（

42、过氧化物酶或碱性磷酸酶）标记的抗体，使待检血清与对应抗原的特异性抗体结合，最后 用分光光度计作出诊断。4、电镜检查法ISEM immunosorbent electron microscope, 灵敏度高，可定量测定植物粗提液中病毒5、RT-PCR 方法Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction将寄主的总 RNA 与 cDNA 合成的试剂盒进行反应， 合成 cDNA ，然后利用病毒 DNA 特有的序列设计的引物进行 PCR 反应，即可知道在寄主中是否有病毒基因的表达，从而 确定病毒是否存在。第二节花药及花粉培养我国花药培养研究始于 1972

43、年。在花药培养的基础研究方面， 我国学者做出了一些公认的研究 成果：1、朱至清发现低铵离子浓度和过滤消毒的单糖显著促进禾谷类花粉胚的发育，建立了N6 和改良 N6 培养基 2、欧阳俊闻确立单核中期的小麦花粉最适于产生花粉植株，较高的培养温度有利于花粉绿苗形成 3、卫志明首次指出大麦遭受碳饥饿可大幅度提高花粉胚的产率。4、孙敬三发现花粉中质体 DNA 降解引起的质体 RNA 和蛋白质的匮乏是白化苗形成的原因。5、烟草“单育一号” 水稻“单丰一号”* 影响花药培养成功率的因素 11、供体的基因型 2、供体植株的生理状况3、花粉的发育时期：单核中晚期至双核早期的花粉最易形成花粉胚或花粉愈伤4、材料的

44、预处理和预培养：低温、离心、乙烯利、甘露醇预处理；高温预培养5、培养基：N6培养基；N6培养基附加6001000mg/L脯氨酸6、培养方式：液体 培养、双层培养、看护培养：条件培养基：已经预先培养过花药（或其它离体细胞）的液体培 养基 7、培养条件：主要调控温度（短期高温培养）和光照（先暗后光）* 游离小孢子培养产生单倍体游离小孢子培养（ isolated microspore culture ），又花粉培养（ pollen culture ）：把小孢子从花药中 分离出来，进行人工培养* 与植物花药培养相比，小孢子培养的优点：1、排除了花药壁和绒毡层的影响，便于分析研究结果 2、需要的器皿和培

45、养空间较小，大大提 高了生产单倍体的效率 3、小孢子本身也可能成为基因工程的受体* 小孢子的分离方法：挤压法、散落法和器械法* 要求小孢子达到以下标准：1、成活率较高，发育期整齐 2、小孢子达到一定数量 3、无菌、无杂质* 单倍体诱导与单倍体育种 单倍体植株：植物学上通常把具有配子体染色体数目的孢子体叫做单倍体植株 多倍单倍体：有些物种由两个以上物种杂交形成，细胞中包含两个以上染色体组，称为多倍二 倍体，其单倍体为多倍单倍体，习惯上仍称作单倍体单倍体：矮小，不育* 单倍体植物在遗传育种上的价值1、利用单倍体植物控制杂种分离，加快常规育种速度2、提高常规育种的选择效率3、利用 H系进行基因定位，

46、绘制遗传图第三节植物胚胎培养被子植物双受精( double fertilization) ：二倍体合子 三倍体胚乳幼胚培养：Hanning (1904); Laibach (1925):最先付诸应用的植物细胞工程技术：20世纪20年代建立的幼胚培养和胚胎拯救( embryo rescue) 技术 中国学者在裸子植物胚胎培养方面的工作?1934 清华的李继侗和沈同发现银杏胚乳提取物可刺激离体胚生长?1941 Van Overbeek 发现椰乳对幼胚发育的促进作用?1943 罗士韦和王伏雄在 Science 发文章，离体培养云南松和云南杉幼胚成功。一、成熟胚培养盾片在胚吸收营养上有重要作用胚胎培养

47、可以解除种皮抑制作用? MS 适用于多种植物成熟胚培养成功例子：杂种桃成熟胚培养与新品种培育二、幼胚培养幼胚在胚珠中异养，离体培养必须提供足够的营养和适宜的条件。双子叶植物胚胎的发育时期：合子( zygote )，二细胞原胚( two-celled proembryo )，球形胚 ( globular embryo )，心形胚( heart-shaped embryo )，鱼雷形胚( torpedo-shaped embryo )， 拐杖形胚(walk in g-stick-shapedembryo),倒 U 形胚(in verted U-shaped embryo),成熟胚(mature e

48、mbryo )。心形胚以后的双子叶胚较易培养，球形胚很难培养。单子叶植物胚胎的发育时期与双子叶植物有很大不同。* 幼胚的培养常用培养基：Nitsch、MS 1/2MS。禾谷类也用N6和B5 幼胚培养需要的蔗糖浓度高于成熟胚,可用代 谢上惰性的甘露醇部分代替蔗糖来调节渗透压。 VB1和生物素对胚胎发育有重要作用。一般不需要外用激素。八分成熟的椰乳对幼胚促进最明显。胚乳看护培养(nurse culture ) 弱光或黑暗培养* 防止幼胚的提前萌发幼胚的提前萌发： 未成熟胚在培养基上未发育为成熟胚, 而提前生长为瘦弱和畸形幼苗的现象。 抑制幼胚提前萌发的因素：提高培养基中蔗糖浓度(10)；加入 AB

49、A(0.010.2mg/L )和酪蛋白水解物(200500mg/L);高温(32C)、强光培养。ABA可抑制幼胚吸水，使其脱水干燥，发育成熟。* 操作实例和经验?双培养基；大麦幼胚培养基：B5 ; 1/2MS无机盐+ MS有机成分 普适于各种禾谷类幼胚培养 ；肌醇添加* 胚胎培养的应用1 、拯救杂种胚获得稀有杂种 胚胎拯救：种间或属间杂交时,两个基因组表达不协调,多数情况下胚乳最先败育,胚仍然健 康,可通过离体胚培养将杂种幼胚培养成植株,称为胚胎拯救。把握好胚胎拯救的时间；盾片的作用；冷处理；先诱导杂种胚产生愈伤,再分化出杂种植株。2、产生单倍体：染色体消除之后,剥离胚培养3 、缩短育种周期：

50、打破休眠4、稀有植物的繁殖：Makapuno* 胚乳培养的意义 胚乳：三倍体 胚乳细胞中储存大量淀粉、蛋白质和脂类,是研究这些产物代谢工程的理想系统 完全由薄壁细胞组成的均质组织,是实验形态发生学研究的极好材料。 胚乳植株三倍体,高产、优质、果实无籽1940 La Rue 最先培养胚乳； 1970 Bhojwani 白花寄生获得胚乳植株；1977, 1978 母锡金 王大元* 胚乳培养和三倍体的产生多数情况先诱导胚乳细胞增生愈伤组织,再诱导愈伤分化器官或胚状体胚和胚乳一起培养有利于胚乳愈伤形成，但之后就应去掉，免得胚愈伤与之混淆 胚乳培养的应用前景：胚乳细胞分裂不规则，胚乳植株中既有三倍体，也

51、有许多非整倍体。三倍体的经济价值：无籽果实；生物量高；品质好；获得三体以进行基因定位。第六章原生质体培养原生质体( protoplast )：植物细胞中，除细胞壁以外的成分* 原生质体研究的意义： 1、研究植物细胞壁的形成 2、实现细胞融合和细胞杂交 3、实现细胞 对外源基因、DNA片段、细胞器、染色体的捕获 原生质体为植物遗传工程研究提供了一个方便的遗传操作实验系统第一节原生质体研究概况 分离原生质体的方法1、机械法：叶肉或其它细胞放在高渗的蔗糖溶液中，使细胞发生质壁分离，原生质体收缩成球 形，完全脱离细胞壁。剪碎组织，可释放原生质体。缺点：产量低，无法从分生组织分离原生质体。2、酶法(在第

52、二节详述)1960，Cocking 最先采用原生质体培养的成果1971， Nagata 和 Takebe 从培养的烟草叶肉细胞原生质体获得完整的再生植株 我国学者在 50 多种植物上首先获得原生质体再生植株，并得到多种植物的细胞杂种第二节原生质体分离1、材料选择及预处理 双子叶植物的幼叶、子叶、根和下胚轴的切段通常被用来制备原生质体 禾谷类植物，疏松易碎的愈伤或悬浮培养的细胞是制备原生质体的理想材料 预处理目的：改变细胞和细胞壁的生理状态，增加细胞膜的强度，提高酶解效率，减少原生质 体损伤。* 预处理方法1、枝条暗处理：获得的原生质体有活力，并能继续分裂。2、叶片萎蔫处理：有利于撕除下表皮和原

53、生质体分离3、叶片预培养：叶片撕掉下表皮，在诱导愈伤的培养基上预培养一段时间，再酶解脱壁，原生 质体分裂频率提高很多。4、预先质壁分离处理：先在糖溶液中质壁分离，再酶解去壁，可加快原生质体释放，提高其活 力。5、胚性愈伤和悬浮细胞系的预培养：新鲜培养基中预培养一段时间再分离原生质体，质量好， 分裂频率高。* 制备原生质体的酶类纤维素酶：自绿色木霉提取 ；果胶酶：自根霉提取，将植物组织解析为单个细胞 崩溃酶：同时具有纤维素酶和果胶酶活性，用于从根尖细胞和培养细胞分离原生质体 半纤维素酶 ；蜗牛酶：对孢粉素和木质素均有一定分解能力，可从花粉母细胞、四分体、小 孢子或较老的植物组织分离原生质体* 酶

54、溶液的配制：为保持释放出的原生质体的活力和膜稳定性，要求酶液满足以下条件：1、酶液渗透压必须与处理细胞的渗透压相似 同一种植物，子叶和下胚轴游离原生质体时需要的渗透压最高，愈伤次之，胚性悬浮细胞要求 最低。可用原生质体培养基做溶剂，其渗透压合适。2、 酶液添加CaCl2 - 2H2O, KH2P0和葡聚糖硫酸钾以提高原生质体膜的稳定性。还可加入AgN03 减少酶解产生的乙烯， 加入过氧化物歧化酶减轻 Q1自由基对细胞膜损伤， 从而提高原生质体植 板率。3、MES（吗啉乙基磺酸）作为 pH缓冲调节剂对于保持酶解物的酸碱环境起缓冲作用，增加原生 质体的释放量和稳定性。4、酶溶液最适 pH 范围为

55、5.45.8 。酶液配好后，过滤灭菌备用。* 原生质体制备材料和酶液体积比：1: 10 ;酶解时间因材料而异；酶解温度 2530C ;黑暗或弱光下酶解 静置或摇床上酶解* 原生质体活力检测方法1、形态：来自叶肉细胞的活原生质体应该绿色，叶绿体及细胞内小颗粒在不停运动；来自愈伤 或悬浮细胞的原生质体， 可根据细胞质内原生质环流速度或颗粒状内含物布朗运动快慢来判断。2、染色： 1酚番红或伊文斯兰染色检测，活的原生质体不着色，死的立即染色。3、 FDA（ Fluorescein diacetate，荧光素双醋酸盐） 活体染色： FDA 能透过原生质体膜，在 内酯酶作用下水解为不能排出的，累积在质膜内的荧光素。在荧光显微镜下观察时，凡发淡绿 荧光的都是活的原生质体。4、CFW（荧光增白剂）染色法：新细胞壁再生产生绿色荧光第三节 原生质体培养1 、供体材料：单双子叶植物有所不同2、培养基 无机盐：大幅度降低铵离子浓度，可以只用硝态氮，同时附加有机氮源。钙离子浓度可适当增加，提高原生质体膜稳定性。碳源和渗透压：葡萄糖最适合，应过滤消毒。原生质体培养， 必须提供一个等渗或稍低于细胞内渗透压的外界环境。有机附加物和激素：VBVB6、烟酸是必需的。很多时候，只需要生长素，尤其2,4-D条件培养基：液体培养基培养生长迅速的细胞一段时间后，除去细胞的培养液pH : 5.65.8,以MES、葡聚