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1、分子生物学第一章绪论分子生物学研究内容有哪些方面？1、结构分子生物学； 2、基因表达的调节与控制； 3、DNA 重组技术及其应用； 4、结构 基因组学、功能基因组学、生物信息学、系统生物学第二章 DNA and Chromosome1、DNA 的变性：在某些理化因素作用下， DNA 双链解开成两条单链的过程。2、DNA 复性：变性 DNA 在适当条件下，分开的两条单链分子按照碱基互补原则重新恢复天 然的双螺旋构象的现象。3、 Tm（熔链温度）:DNA加热变性时，紫外吸收达到最大值的一半时的温度，即DNA分子 内 50%的双链结构被解开成单链分子时的温度）4、退火：热变性的 DNA 经缓慢冷却后

2、即可复性，称为退火5、 假基因：基因组中存在的一段与正常基因非常相似但不能表达的DNA序列。以屮来表示。6 C值矛盾或C值悖论:C值的大小与生物的复杂度和进化的地位并不一致，称为C值矛盾或 C 值悖论（C-Value Paradox。7 、转座：可移动因子介导的遗传物质的重排现象。8、转座子：染色体、质粒或噬菌体上可以转移位置的遗传成分9、 DNA二级结构的特点：1） DNA分子是由两条相互平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成；2）DNA 分子中的脱氧核苷酸和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在外侧；3）DNA分子表面有大沟和小沟；4）两条链间存在碱基互补，通过氢键连系，且A=T G三C

3、（碱 基互补原则）；5）螺旋的螺距为3.4nm,直径为2nm相邻两个碱基对之间的垂直距离为 0.34nm, 每圈螺旋包含 10个碱基对； 6）碱基平面与螺旋纵轴接近垂直，糖环平面接近平行10、真核生物基因组结构：编码蛋白质或RNA勺编码序列和非编码序列，包括编码区两侧的调 控序列和编码序列间的间隔序列。特点：1）真核基因组结构庞大 哺乳类生物大于2X109bp； 2）单顺反子（单顺反子：一 个基因单独转录，一个基因一条 mRNA翻译成一条多肽链；）3）基因不连续性断裂基因（interrupted gene ）、内含子（intron）、 外显子（exon） ； 4）非编码区较多，多于编码序 列（

4、9:1） 5 ）含有大量重复序列11、Histon（ 组蛋白）特点：极端保守性、无组织特异性、氨基酸分布的不对称性、可修饰作 用、富含 Lys 的 H512、核小体组成： 由组蛋白和200bp DNA组成13、 转座的机制：转座时发生的插入作用有一个普遍的特征，那就是受体分子中有一段很短的 被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。复制型转座：整个转座子被复制，所移动和转位的仅为原转座子的拷贝。 非复制型转座：原始转座子作为一个可移动的实体直接被移位。第三章 DNA Replication and repair1、半保留复制：DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单

5、链，各自作为模板（template）按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA 一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为 半保留复制。2、复制子：生物体内能独立进行复制的单位3、 前导链：以复制叉移动的方向为标准，一条模板链的走向是3f 5,子代链复制时以 5一 3方向连续合成，这一条链称为前导链4、 滞后链：另一条模板链的走向是5一3，子代链通过不连续的5/-3 /聚合而成，称 为滞后链(lagging strand)。5、 冈崎片段：滞后链的合成是一段一段的。DNAS制时，由滞后链所形成的子代 DNA

6、短链称 为冈崎片段6、 端粒：是真核生物线性染色体末端的特殊结构，含物种特异性(species-specific )的DNA 重复序列。7、 逆转录：以RNA为模板，按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA勺过程，称为反转录(reverse tran scripti on, RT)。该过程由逆转录酶催化进行，亦称反转录8、DNA复制的主要特征：半保留复制、 双向复制、 半不连续复制、 保真性9、DNAM制的几种方式：环状DMA(unidirectional) n如蜿奮(adenovirus)bidirectional):如T7菌体TTphag司0 形:如 E. coli取向(bidirectiona

7、l)滚裡(rolling circle):Jfflx174 单向(unidirectional)DH(D-loop):如动物线粒体DN/VMostly,双向等速！10、DNA polymerases (DNA 聚合酶)in E. Coli 及其主要功能三种酶均有:T 亍外切酶活性，说明均有校正功能表 E coif D NA聚合酶性质的比较Pel 1Pol IIPol III5-3 Poi+3-5exo+5* -3Jexo新生锂合成十忙物学活性10.0515结pol Apc/ Bpol CDNA Pol IV: din B 编码 DNA Pol V: umc C, umc D 编码两者涉及DNA

8、的错误倾向修复 （error-prone repair）。当DNA受到较严重损伤时，即可诱导产生这两个酶， 使修复缺乏准确性（accuracy），因而出现高突变率。高突变率虽会杀死许多细胞，但至少可以克服复制障碍,使少数突变的细胞得以存活。11、单链DNA结合蛋白（SSB）：在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。其 作用是保证被解链酶解开的单链在复制完成之前能保持单链结构。12、常见的真核细胞DNA聚合酶及其功能DNA-pol a起始引发，有引物酶活性。DNA-pol高保真修复酶”碱基切除修复-DNA-pol在线粒体DNAM制中起催化作用.DNA-pol &延长子赞的主要酶，有解螺旅酶

9、活性DNA-pol参与合成后随链，在复制过程中起校 读.修复和填补缺口的作用。13、原核生物DNA复制的过程（课本 P50-P52）1）复制的起始：识别起始点，合成引发体：在E.coli，DnaA蛋白识别并结合ori， DnaC协助DnaB蛋白（解链酶，helicase）结合于ori , DNA双链局部被打开，引物酶及其他蛋白加入，形成引发体。形成单链：促旋酶（II型拓扑异构酶）解开 DNA超螺旋，解链酶解开双链，单链结合蛋白 SSB结合 于处于单链状态模板链上。合成引物：前导链 的引物由RNA聚合酶合成，滞后链的引物由引发酶合成。引物提供3 -OH，复制进入延伸阶段2）复制的延伸:按照与模板

10、链碱基配对的原则，在DNA聚合酶III的作用下，逐个加入脱氧核糖核酸，使链延长。DNA聚合酶的即时校读和碱基选择功能，确保复制的保真性。由于DNA双链走向相反，DNA聚合酶只能催化核苷酸从 5 3方向合成，前导链的复制方向与 解链方向一致，可以连续复制，而另一模板链沿5t 3方向解开，随从链（滞后链）的复制方向与解链方向相反，复制只能在模板链解开一定长度后进行，因此随从链的合成是不连续的，形成的是若干个岗崎 片段。 DNA聚合酶I的3 -5核酸外切酶活性去除 RNA引物。DNA聚合酶I填补DNA间隙。连接酶 使相邻两个DNA片段的3 -OH末端和5 -P末端形成3, 5磷酸二酯键。3）复制的终

11、止：两个复制叉的汇合点就是复制的终点。两个复制叉向前推移，在终止区相遇而停止 复制，复制体解体14、 DNA复制过程中后随链的合成：后随链开始合成 DNA时，需要一段RNA引物、后随链的引发过程引 发体来完成引发体像火车头一样在后随链分叉的方向上前进，并在模板上断断续续地引发生成后随链的引物RNA短链，再由DNA聚合酶III作用合成DNA，直到遇到下一个引物或冈崎片段为止。由 RNaseH降解RNA引物并由DNA聚合酶I将缺口补齐，再由DNA连接酶将两个冈崎片段连 接在一起形成大分子DNA。15、 与原核生物相比真核生物 DNA复制的特点：DNA复制发生在细胞周期的S期；染色体DNA有多个复制

12、起点，为多复制子；冈崎片段长约100 200 bp。每个复制子在染色体DNA全部复制完成前，不能再开始新一轮复制；而在快速生长的原核中， 起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。复制叉移动速度较原核生物慢（1/20）;真核生物线性染色体两端有端粒结构，防止染色体间的末端连接和核酸酶降解。由端粒酶负责 新合成链5 端RNA引物切除后的填补，保持端粒的一定长度。16、几种修复机制：1 ）直接修复2 ）错配修复3 ）切除修复4 ）重组修复5）S0S修复第四章转录概念：模板链与编码链：DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成 RNA的一股单链，称为模板链 （template

13、strand），也称作有意义链或 Watson链。相对的另一股单链 是编码链（coding strand），也称为反义 链或Crick链。启动子：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。终止子（terminator ）:提供转录终止信号的 DNA序列。 终止因子（termination factor） :协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子（蛋白质）。 外显子&内含子：不编码的插入序列， 称内含子；编码的序列 称外显子。断裂基因：大多数真核生物基因的核苷酸顺序不全部反映到蛋白质一级结构上。基因的编码序列被不编码的插入序列分割成几段，这样的基因称为断裂基因。RNA编辑：mRNA分子由

14、于核苷酸的缺失、插入或置换导致序列发生了不同于模板DNA的变化，这种现象称为RNA编辑。RNA聚合酶组成：1）原核生物 2个a亚基、1个B亚基、1个次B亚基、1个3亚基、1个b亚基构成 RNA聚合酶的全酶。2 ）真核生物一一一般有 8-16个亚基，有两个分子质量超过100000的大亚基，同种生物3类聚合酶（聚合酶I、川）有共享小亚基的倾向即有几个小亚基是3类或2类聚合酶所共有的。b 70识别的启动子：E. coli中b 70识别的启动子包含 2个保守的核心序列-10区和-35区：-10 区（TATA box, Pribnow box）中心位于转录起始位点上游10bp处，一致序列（Consens

15、us sequenee为T80A95T45A60A50T96, 所以称-10 区。（右下角的数字表示该碱基在这个位置出现的百分率）功能：与RNA聚合酶紧密结合；形成开放启动子复合体；使 RNA聚合酶定向转录-35 区（Sextama box）中心位于转录起始位点上游35bp处，一致序列为 T82T84G78A65C54A45。功能：RNA聚合酶的识别位点，为转录选择模版；-10区和-35区距离相当稳定，过大过小会影响转录活性转录的基本过程： 起始（initiation）、延伸（elongation）、终止（termination ）。终止子的2个类型：强终止子（内部终止子）一一不依赖于p因子弱

16、终止子一一依赖于p因子真核生物中的三种RNA聚合酶存在部位及作用酶位置转录产物相对活性对a -鹅膏蕈碱的敏感性RNA聚合酶I核仁rRNA50-70%不敏感RNA聚合酶n核质hn RNA20-40%敏感RNA聚合酶川核质tRNA约10%存在物种特异性真核生物mRNA加工5 capping （ 5加帽）3 polyadenylation （ 3力口 poly A 尾巴）splicing （拼接）primary product （原初产物） ：hnRNA （ intron, exon）RNA edit ing （编辑）modificati on （修饰）原核和真核细胞的mRNA的异同同：功能相同，即

17、通过三联密码子翻译生成蛋白质异：1）真核细胞5端存在帽子结构；绝大多数具有多尾巴；2）原核细胞：mRNA半衰期短；许多原核生物mRNA可能以多顺反子的形式存在；5端无帽子结构，3端没有或只有较短的多（A）结构第五章翻译密码子：在mRNA的开放阅读框架区，以每3个相邻的核苷酸为一组，代表一种氨基酸（或其他信息），这种三联体形式的核苷酸序列称为密码子。SD序列：在各种mRNA起始AUG上游约813核苷酸部位，存在一段由49个核苷酸组成的一致序列，富含嘌呤碱基， 如-AGGAGG-,称为Shine-Dalgarno序列（S-D序列），又称核糖体结合位点 （ribosomal binding site

18、, RBS）。密码子的特点：1.方向性（directional）2.连续性（non-punctuated）3. 简并性（degeneracy）4.摆动性（wobble）5. 诵用性（universal）起始密码子（initiation codon） : AUG终止密码子（termination codon）: uaa、uag、ugatRNA的二级构象特点：三叶草型四个环一个臂tRNA的二级结构三叶草形、氨基酸臂、DHU环、反密码环、额外环、T C环三种RNA在蛋白质生物合成中的作用：mRNA的功能：把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排

19、列顺序。rRNA的功能：参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。tRNA的作用：运载氨基酸：氨基酸各由其特异的tRNA携带，一种氨基酸可有几种对应的tRNA，氨基酸结合在tRNA 3 / -CCA的位置，结合需要 ATP供能；充当适配器”：每种 tRNA的反密码子决定了所携带的氨基酸能准确地在mRNA上对号入座。蛋白质合成的部位、过程？核糖体是蛋白质合成的场所。蛋白质合成过程： 翻译的起始 核糖体与mRNA结合并与氨基酰-tRNA生成起始复合物； 肽链的延伸 核 糖体沿mRNA5 端向3端移动，开始从 N端向C端的多肽合成； 肽链的终止及释放 核糖体从mRNA 上解离准备新一轮的合成反应。

20、原核细胞和真核细胞在合成蛋白质的起始有什么区别？(起始因子、起始氨酰-tRNA、核糖体不同等)原核细胞真核细胞起始因子IF-1,IF-2,IF-3elF-3 , eIF-2B、eIF-3、 eIF-6 elF-5,起始tRNAfMet-tRNAfMetMet-tRNAMet核糖体30S小亚基首先与mRNA模板相结合， 再与 fMet-tRNAfMet 结合，最后与 50S 大亚基结合。40S小亚基首先与 Met-tRNAMet相结合，再与 模板mRNA结合，最后与60S大亚基结合生成80S mRNA Met-tRNAMet 起始复合物翻译的特点:真核生物原核生物遗传密码相同相同转录与翻译不偶联

21、，mRNA的前体要加工偶联起始因子多、起始复杂少mRNA5端：帽子，3 端：尾巴，单顺反子5端：Kozazk序列无需加工，多顺反子，5端：SD序列核糖体大而复杂简单起始tRNAtRNAimettRNAifmet合成过程需ATP ,起始因子多，延长因子少(EFT1、EFT2)，一种释放因子需 ATP、GTP, IF1、IF2、IF3EF-TU、EF-TS、EFG、RF1、RF2、RF3线粒体，叶绿体独立的蛋白质合成系统肽链延长过程1. 进位(positioning)/注册(registration):根据mRNA下一组遗传密码指导， 使相应氨基酰-tRNA进入核蛋白体 A位。通过延伸因子 EF-

22、Ts再生GTP,形成EF-Tu?3TP复合物重新参与下一轮循环。需要消耗GTP，并需 EF-Tu、EF-Ts两种延伸因子2. 成肽(peptide bo nd formatio n)：是由转肽酶(tran speptidase 催化的肽键形成过程3. 转位(translocation):核糖体向 mRNA3 端方向移动一个密码子。需要消耗GTP，并需EF-G延伸因子真核生物肽链合成的延长过程与原核基本相似，但有不同的反应体系和延长因子。 另外，真核细胞核蛋白体没有E位，转位时卸载的tRNA直接从P位脱落。蛋白质合成后的加工修饰有哪些内容翻译后加工一级结构的修饰：N-端 Met(fMet)去除二

23、硫键的形成个别氨基酸的修饰羟化作用：羟脯氨酸羟赖氨酸酶活性中心的磷酸化多蛋白的加工一条合成后的多肽链经加工产生多种不同活 性的蛋白质/多肽高级结构的修饰：亚基的聚合HbA亚单位聚合结合蛋白质的合成糖蛋白的合成辅基连接辅基(辅酶)与肽链的结合蛋白转运的2种机制：翻译中转运(cotranslational transport):蛋白质合成与跨膜运送是同时进行的。 翻译后转运(posttranslational transport):蛋白质在核糖体上合成后释放到胞质中。当它们跨膜运 送时，合成过程已完成，故称为“转译后运送”第六章分子生物学研究法限制性核酸内切酶:(RE)是一类核酸内切酶，能识别双链

24、DNA分子内部的特异序列，并裂解磷酸二酯键。载体：指基因工程中携带外源基因进入受体细胞的运载工具，其本质是DNA复制子。核酸分子杂交：在DNA复性过程中，如果把不同 DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在 DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化 双链(heteroduplex)Southern杂交：即将DNA经限制性酶切，凝胶电泳后，再转移至膜上与标记探针杂交的一种核酸分子 杂交技术。特异性，敏感性，准确性具佳。主要用于检测基因组中特定的基因和序列，也常用于鉴定克隆 DNA的特殊序列。Northern杂交：即将电泳分离后的变性

25、 RNA吸印到适当的膜上再进行分子杂交的技术。重组DNA支术中常用的工具酶：限制性核酸内切酶、 DNA聚合酶I、逆转录酶、T4DNA连接酶、碱性磷酸酶、末端转移酶、Taq DNA聚合酶。重组DNA技术中常用的载体：载体按功能分为克隆载体：为使插入的外源 DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。质粒、噬菌体、柯斯质粒载体（又称黏粒载体） 、酵母人工染色体、 细菌人工染色体、 动物病毒DNA改造的载体（如腺病 毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）表达载体:为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。根据宿主细胞分为：原核表达载体、真核表达载体。PCR的反应体系：模板D

26、NA、特异性引物、耐热 DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+。PCR的原理：针对目的DNA的5 -和3 -端，设计一对特异引物，在每条引物的5 -端分别加上不同的RE位点，然后以目的 DNA为模板，经PCR扩增便可得到带有引物序列的目的DNA，再用相应RE切割PCR产物，产生黏端，随后便可与带有相同黏端的线性化载体进行有效连接。PCR的用途：（一）目的基因的克隆（二）基因突变（三） DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列测定 （五）基因突变分析第七章 原核基因表达调控操纵子：在原核生物中受同一蛋白质调控的一个转录功能单位，由启动子（promoter ）、操纵基因（operator）和结构基因（

27、structural gene）组成。结构基因：编码蛋白质或 RNA的基因。调节基因：产生调控蛋白，调控结构基因表达的基因。弱化子：指原核生物操纵子中，能显著减弱或终止转录作用的一段核苷酸序列。转录因子：包括转录激活因子和转录阻遏因子。这类调节蛋白能识别并结合转录起始位点的上游序列或远端增强子元件，通过 DNA 蛋白质相互作用。魔斑核苷酸：是细菌生长过程中在缺乏氨基酸供应时产生的一个应急产物。主要是三磷酸鸟苷（GTP ）合成的四磷酸鸟苷（ppGpp）和五磷酸鸟苷（pppGpp）。主要功能是干扰 RNA聚合酶与启动子结合的专一性， 诱发细菌的应急反应，帮助细菌在不良环境条件下得以存活。简述乳糖操

28、纵子在无乳糖、添加乳糖、葡萄糖和乳糖都存在时的工作原理。1没有乳糖，只有葡萄糖时，不产生利用乳糖的酶。 有葡萄糖及CAMP浓度低时，CAP活性低，没有正调控。 没有乳糖，没有半乳糖时，阻遏蛋白可与操纵序列结合，起负调控作用。由于、转录受抑制，不产 生利用乳糖的酶。2. 有葡萄糖，又有乳糖时，不利用乳糖。 有葡萄糖及CAMP浓度低时，CAP活性低，没有正调控。 有乳糖，有半乳糖，阻遏蛋白不可与操纵序列结合，无负调控。由于没有正调控，转录处于低水平状态，不产生利用乳糖的酶，细菌优先利用葡萄糖。没有葡萄糖，只有乳糖时，利用乳糖。3. 没有葡萄糖，只有乳糖时，利用乳糖。 没有葡萄糖及CAMP浓度高时，

29、CAP活性高，有正调控。 有乳糖，有半乳糖，阻遏蛋白不可与操纵序列结合，无负调控。转录处于高水平，利用乳糖酶大量合成。乳糖操纵子的组成和作用机制1、孚L糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列 0,个启动子P和一个调节基因I.2、作用机制：1） 阻遏蛋白的负性调节： 没有乳糖存在时,1基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列 0处,乳糖操纵子处于阻 遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时 ，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构 ，不能结合于操纵序 列,乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶 .所以,乳糖操纵子的这

30、种调控机制为可诱导的负调控 2） CAP的正性调节：在启动子上游有 CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳 源的环境时，cAMP浓度升高,与CAP结合,使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点,激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶 3） 协调调节：乳糖操纵子中的I基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP的正调控两种机制，互相协调、互相 制约色氨酸调控机制：大肠杆菌色氨酸操纵子的转录受阻遏机制和弱化机制两种机制的控制，前者通过阻遏蛋白和操纵基因的作用控制转

31、录的起始，后者通过前导序列形成特殊的空间结构控制转录起始后是否进行下去。）色氨酸操纵子的可阻遏系统 ：在阻遏系统中，起负调控的调节基因的产物是一个无活性的阻遏蛋白，色 氨酸是辅阻遏物；当色氨酸不足时，阻遏蛋白无活性，不能和操纵基因结合，色氨酸操纵子能够转录；当 色氨酸充足时，阻遏蛋白和它结合而被激活，从而结合到操纵基因上，而色氨酸操纵子的操纵基因位于启 动基因内，因此，活性阻遏物的结合排斥了RNA聚合酶的结合，从而抑制了结构基因的表达。弱化子工作的原理及其生物学意义原理：原核生物中，转录和翻译偶连。前导区的转录紧接着前导mRNA的翻译；前导肽mRNA含2个连续的Trp密码子，其翻译对运载色氨酸

32、的tRNA浓度敏感。如果细胞中 Trp浓度很低，核糖体就会在此暂停； 核糖体的暂停改变前导 mRNA的二级结构，4区被转录完成时核糖体才进行到1区，前导区结构为 2&3配对，不形成内在性终止子（3-4配对）结构，转录继续。如果细胞中Trp浓度高，核糖体很快通过 2个连续的Trp密码子，在4区被转录之前就到达 2区，3&4配对，形成内在性终止子结 构，转录终止。生物学意义：氨基酸合成中的反馈抑制。经济的原则。细菌利用阻遏和弱化双重机制感受细胞内外Trp的变化，精确调控 Trp的合成。反应灵敏。单独的弱化作用的效率很高，其他氨基酸操纵子如His、Leu，没有阻遏蛋白，全靠弱化作用调节。效率高。提供了一条不依靠调节蛋白，只依赖RNA结构的基因表达调控途径。科学上，把培养基中营养缺乏，蛋白质合成停止后，RNA合成也趋于停止这种现象称为 严紧控制（rel+）；反之则称为松散控制（rel-）。魔斑的主要作用：（1） ppGpp 四磷酸鸟苷（魔斑 I magic spot I）调控一些反应的效应物，主要功能是： 抑制rRNA基因的启动子与 RNA聚合酶与结合的专一性； 抑制多数或大多数基因转录的延伸。pppGpp 五磷酸鸟苷（魔斑II magic spot II）当细胞缺乏氨基酸时产生ppGpp，可在很大范围内做出应急反应，如抑制核糖体和其他大分子的合成，活化某些