人源胸腺素α原和白介素2融合蛋白的基因克隆与原核表达

1、DOC格式论文，方便您的复制修改删减人源胸腺素a原和白介素2融合蛋白的基因克隆与原核表达（作者：单位：邮编：）【摘要】 目的 克隆人胸腺素a原/白介素2融合基因，构 建其原核表达载体并在大肠杆菌系统中有效表达。方法米用RT PCR方法，从人白血病细胞和人T淋巴细胞中分别扩增得到胸腺 素a原/白介素2基因，利用基因重组技术将融合基因片段重组于 pET42a原核表达载体上，构建成pET42a_PI。经酶切、测序鉴定后， 将重组质粒转化大肠杆菌 Rosseta，IPTG诱导蛋白表达。表达产物 经离子交换和分子筛纯化后进行 Western blot分析，通过人外周血单 核细胞玫瑰花结实验对融合蛋白进行

2、了初步的活性测定。结果凝胶电泳显示PCR产物的长度约750 bp，测序结果表明，扩增片段与预 期序列一致。重组菌在IPTG诱导下表达相对分子质量为28 kDa的 蛋白，纯化后的融合蛋白能提高人外周血单核细胞玫瑰花结形成率， 表明具有一定活性。结论 成功克隆和构建了人胸腺素a原/白介素2 融合基因的原核表达载体，并在原核表达系统中得到有效表达。【关键词】 胸腺素a原；白介素2 ；融合蛋白；表达Abstract:Objective To clone human prothymosina andinterleukin 2 fusion gene into the prokaryotic expres

3、sion vector and to express the fusion protein effectively in E.coli system.Methods The human prothymosin a and interleukin 2 gene were amplified by RTPCR from human leukemia cells and T lymphocytes respectively. The two genes were fused with a lin ker and the fusi on gene fragme nt was used to con s

4、truct a prokaryotic expressi on vector pET42a JPI by DNArecomb inanttech niq ue.Afteridentification by restriction analysis and DNA sequencing, the recomb inant plasmid was tran sformed into E.coli Rosetta. The overexpressed protein induced by IPTG was purified by anion excha nge chromatography and

5、Sephacryl S200 chromatography.The biological activity of the fusion protein was assayed using T cell E rosette formatio n test of huma n blood. Results The PCR product was about 750 bp in len gth, which was con siste nt with the expected size of the fusi on gene. Plasmid pET42aPI was tran sformed in

6、toRosetta and a new protein with a relative molecular weight of 28 kDa was expressed. The purified fusi on prote in could in crease the E rosette formati onrate of huma n peripheral mononu clearcells.C on clusi on The en codi ng seque nee of huma n prothymos inaand in terleuk in 2 fusion gene was su

7、ccessfully cloned in to the prokaryotical expression vector pET42a and can be expressed effectively in E.coli system.Key words:prothymosina； interleukin 2; fusion protein;expressi on人源胸腺素a原（prothymosin a, proT a是由109个氨基酸组成的一种小分子酸性蛋白。它具有多种不同的生物学活性，主要是促进 细胞增殖和具有免疫调节剂的作用1-3 。胸腺素a原作为细胞外信 号蛋白，对细胞凋亡起调节作用，

8、在细胞凋亡抑制剂的协同下可预防 脑部中风4。Skopeliti等5在外周血单核细胞的培养过程中加 入proT a,培养液中检测到IL1及其受体、hsp90等多种蛋白的过度 表达，而产生的IL_1可激活T细胞受体而促进T细胞增殖和IL2的 产生。人白细胞介素2 （Interleukin2, IL 是由133个氨基酸组成的 多肽。Burchill :6等人研究发现IL2和IL2R（IL2受体）主要是调整 T细胞生长和维持T细胞的稳定。IL2可缩短脑脊髓炎自身免疫过程 并增强荷瘤鼠的免疫调节作用，对因移植性或化学方法诱发的肿瘤产 生治疗效果7。IL2还能提高NK细胞（自然杀伤细胞）和 LAK 细胞（

9、淋巴因子激活的杀伤细胞）的活性，可以用于治疗癌症，但是 过度使用IL2会带来不良反应。IL2和proT a协同作用于自体肿瘤的 反应比单独使用1口2所引起的反应要强8,9。IL2和proT a的联合 使用不仅能降低单独使用IL2产生的毒副作用，而且还能够提高抗肿 瘤的效果8,10。因此，本研究将IL2和proT a进行融合，并引入 柔性连接肽Linker，构建了 proT 12融合蛋白的原核表达载体 pET42a_PI，并在大肠杆菌系统中得到了有效表达，为进一步研究该融合蛋白的功能奠定基础。1材料与方法1.1材料菌种Rosetta(DE3)、载体pET42a由本实验室保存。RNA提取试 剂盒：

10、Qiagen公司，RT PCR试剂盒、限制性内切酶Nde I和Xho I、 T4DNA 连接酶、DNA Fragment Quick Purification/Recover Kit 购自 大连宝生物公司，HRP兔抗羊酶标二抗购自Sigma公司，人HL60 白血病细胞购自中山大学， HitrapTM Q阴离子交换柱、Sephacryl S200购自安玛西亚公司，其他试剂均是进口或国产的分析纯试剂。1.2方法1.2.1引物设计将白介素2融合于胸腺素a原的羧基端，为保持两者的活性， 在两者之间放入一段连接肽，连接肽的组成：SGg G G S。proT a基因的克隆：上游引物：P1 : 5 CCAG

11、GATCCCATATGTCA GACGCAGCCGTAG 3 ;下游弓I 物：P2 :5 ACTAAGCTTTTAGTCATCCTCGTCGGTCTTC ”3扎2 基因的克隆：上游引 物 :P3 :5GTCGGATCCATGGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAA 3下游引物：P4 : 5 CCAGGCTCGAGTTAAGTTAGTGTTGAGATGATGCTTTG3 。proT a /IL 2融合基因的克隆：上游引物：P5 :5 1TTCTTTGTAGAACTTGAAGTAGGTGCAGAG CCACCGCCACCCGAGTCATCCTCGTCGGTCTTCT 3 下游弓 I物：

12、 P6 :5AGAAGACCGACGAGGATGACTCGGGTGGCGGTGGCTCTGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAA 3 。其中，引物P1和P4分别引入了限制性酶切位 点 Nde I 和 Xho I。1.2.2目的基因的PCR扩增用引物P1和P2从人HLJ60白血病细胞中进行 RT PCR克隆 出proT a基因；用引物P3和P4从人T淋巴细胞中进行RTpCR克 隆出IL2基因；以IL2 DNA片段为模板，用引物P3和P5进行PCR , 获得linkerL【2;以proT aDNA片段为模板，用引物 P4和P6进行 PCR，获得 linkerproT a 用 linke

13、r IL2 和 linkerproT aDNA 片段以 1 : 1混合作为模板，用引物P1和P6进行PCR，扩增出融合基因proT alinkerlL2 DNA片段（PI）。每步PCR都包含相应的模板和上下游 引物、Tag聚合酶、dNTPs ，PCR仪设定的扩增条件：先在94 C 变性 5 min，再于 94 C 1 min，58 C 1 min，72 C 1 min 进行 30 个循环，最后于72 C延伸10 min，PCR结束后，取1山反应液进 行10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。PCR产物用低熔点琼脂 糖凝胶电泳分离后，DNA回收试剂盒回收纯化。1.2.3重组质粒pET42a_P

14、I的构建及鉴定用限制性内切酶Nde I、Xho I对经试剂盒纯化后的PCR产物 和表达载体pET42a进行双酶切，酶切完毕，10 g/L琼脂糖凝胶电泳， 切下胶中所需片段，以 DNA Fragment Quick Purification/Recover Kit回收。酶切后的PCR产物与回收后的载体用T4DNA连接酶连接。 连接产物转化大肠杆菌 Rosseta ,将重组菌Rosseta/pET42a P涂布 于含有35/mL氯霉素和100 g/mL卡那霉素的LB琼脂平板， 挑取阳性单克隆，置含相应抗生素的 LB培养液的试管中37 C振摇 过夜，用碱裂解法小量制备质粒 DNA，获取的质粒分别用

15、Nde 和 Xho 单、双酶切，10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，质粒进行 DNA测 序鉴定。1.2.4融合蛋白的诱导表达将鉴定正确的阳性克隆菌株 Rosseta/pET42a P，接种到含有35 g g/mL氯霉素和100 gj/mL卡那霉素的5 mL LB培养基中，在37 C 以180 r/min培养过夜，以1 50比例接种至含相应抗生素的50 mL LB中，在37 C，180 r/min条件下培养至A600为0.40.5，用 终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导蛋白表达。之后在同等条件下继续 培养4 h。取适量菌液在4 C条件下，5 000 r/min条件下离心5 min， 菌体沉淀用1

16、 mL细菌裂解液（50 mmol/L TrisHCI，pH=7.2，50 mmol/L NaCI ）重悬。重悬液用超声法破碎细胞，裂解菌体再在13 000 r/min条件下离心5 min。分别取菌体裂解上清液（可溶蛋白部分） 和沉淀重悬液（不可溶蛋白部分）各 10山，SDSPAGE电泳分析 蛋白表达情况。1.2.5融合蛋白的纯化菌体经超声破碎后，4 C，13 000 r/ min，离心10 min，取上 清，用0.22 gm低蛋白吸附的滤器过滤后上样。经阴离子交换柱粗 纯（平衡缓冲液 50 mmol/L Tris HCI，pH7.5，10 mmol/L NaCI ;洗 脱缓冲液 50 mmol

17、/L Tris HCI, pH7.5 , 500 mmol/L NaCI ),洗脱峰 再过 Sephacryl S 200 分子筛(20 mmol/L TrisHCI， 150 mmol/L NaCI，pH7.5)，收集洗脱峰并进行SDSPAGE电泳分析。1.2.6 融合蛋白的 Western blot分析纯化后的融合蛋白样品，用 SDSPAGE分析，将凝胶上的蛋 白转移至硝酸纤维素膜，30 V过夜。用封闭液含5%脱脂奶粉的 TBST (20 mmol/L TrisjHCl，pH7.5，500 mmol/L NaCl，0.05% Tween20门室温封闭1 h，TBST洗膜3次，每次10 mi

18、n，加入羊 抗IL 2单克隆抗体，室温孵育1 h。重复洗膜3次，加入辣根过氧化 物酶标记的兔抗羊IgG，室温作用1 h，再洗膜3次，加入DAB显色 液，室温静置，用蒸馏水终止反应。1.2.7融合蛋白活性初步鉴定按常规方法用淋巴分离液分离健康人外周血单核细胞，1 %台盼蓝染色计数细胞。用含血清的培养液调整细胞数至2 X106个/mL。各取细胞液100山入试管，分为生理盐水组及不同浓度的纯化蛋白 组：1 X10-7、1 X10-8、1 x10-9mol/L 组，37 C水浴 90 min ;用 生理盐水洗涤绵羊红细胞，将细胞数调整至2X108个/mL;在每支试 管中加入绵羊红细胞100山，在4 C

19、放置23 h;涂片，染色，于 高倍镜下计数200个淋巴细胞中形成玫瑰花结的细胞数(结合3个及 3个以上绵羊红细胞)，计算玫瑰花形成细胞的百分数。2结果2.1 PI基因的RT_PCR结果及克隆载体的构建与鉴定以特异 性引物经PCR扩增后，PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析，获 得约750 bp大小的DNA片段（如图1），产物回收后进行Xho I和NdeI双酶切并连入原核表达载体pET42a中，形成重组表达质粒pET42aPI，转化大肠杆菌Rosseta，挑取阳性克隆抽提质粒，分别 用Xho I、Nde I进行单、双酶切，酶切结果如图2,双酶切片断与预 期片断大小一致，测序结果与预期序列一致。2

20、.3融合蛋白的表达重组菌 Rosseta/ pET42a PI 在 1 mmol/L IPTG 37 C条件下诱导 表达4 h，菌体经超声波破碎，SDSPAGE电泳结果显示，在分子量 为28 kDa处有蛋白过量表达，与预期的融合蛋白大小一致（如图3）， 且融合蛋白以可溶形式存在。2. 4融合蛋白的纯化可溶性融合蛋白采用 HitrapTM Q阴离子交换柱和 Sephacryl S200分子筛纯化（图4）后，洗脱峰经SDSPAGE电泳分析，蛋 白纯度可达95%以上（图5）。纯化的融合蛋白经 Western blot分析, 在杂交膜上出现了明显的单一条带，分子量约为 28 kDa （图6）。2.6

21、E玫瑰花结实验将纯化的融合蛋白稀释成不同的浓度，分别加到人外周血单核细胞 悬液中与绵羊红细胞一起温育，与对照相比，可以明显提高淋巴细胞 玫瑰花结形成率，结果见表1。这表明大肠杆菌表达的融合蛋白具有 一定的活性。表1融合蛋白对人外周血单核细胞 E玫瑰花结形成率 的影响（略）3讨论本实验使用的菌株为 Rosetta ( DE3)菌株，它是经过修 饰后专用于带有大肠杆菌稀有密码子的原核蛋白表达的菌株。多数氨基酸有不止一个密码子，而不同的生物使用这61个密码子的偏爱性不同，对大肠杆菌密码子应用情况的分析表明，一些密码子很少使用， 尤其是 Arg 密码子 AGA，AGG，CGG，CGA，lie 密码子

22、CUA，Gly 密码子GGA和Pro密码子CCC很少被用到。ProT 1口2融合蛋白 基因中共有13个稀有密码子，而且还有3个密码子连续出现，这会 影响融合蛋白在大肠杆菌中的表达。事实证明，proT 01口2融合基因在选用BL21作为宿主菌时，根本检测不到目的蛋白。基于这种情 况,本实验从众多的宿主菌中挑选 Rosetta作为表达菌，获得了该融 合蛋白的可溶性表达。Rosetta菌株还能够由一种氯霉素抗性的、与 pET 相容的质粒提供 AUA ,AGG ,AGA ,CUA ,CCC 和 GGA 的 tRNA， 所以这类菌株能够明显改善大肠杆菌中由于稀有密码子造成的表达 限制。在proT aiL

23、_2融合蛋白基因构建中，为了使表达的两种细胞 因子的空间构象尽量与天然产物相近，以保持其最大的生物学活性， 本实验在引物中设计了 6个亲水性和低电荷效应的氨基酸序列作为 接头(4个Gly、2个Ser)，因为甘氨酸结构简单，对融合蛋白的立体 构象影响较小。综合以上，本实验成功地利用PCR方法扩增了人IL2/proTa融合基因，将其克隆到原核表达载体pET42a上，并转化大肠杆菌 Rosetta，通过IPTG诱导成功表达并纯化获得了IL2/proT a融合蛋白。玫瑰花结实验表明，纯化后的融合蛋白具有一定的生物学活性。 本研究为进一步研究该融合蛋白的生物学活性奠定了一定基础。【参考文献】:1 BUT

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25、from CD8+ T lymphocytes in hibits huma n immuno deficie ncy virus type 1 replicati on through STAT1 activati on:J . J Virol, 2002,76(2):569-581.:3 COCCHI F, DEVICO A L, GARZINO DEMO A, et al.Identification of RANTES, MIP1a and MIP1b as the major Hivsuppressive factors produced by CD8+ T cells J Scie

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