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1、一、立一、立项项依据与研究内容依据与研究内容 （一）（一）项项目的立目的立项项依据依据 dna 错配修复(mismatch repair, mmr)系统广泛存在于生物体中，它是细胞 复制后的一种修复机制1-3。其功能是在含有错配碱基的 dna 分子中切除配对 错误的片段，然后通过 dna 聚合酶和 dna 连接酶等的作用，重新合成配对正 确的片段，使 dna 恢复正常的核苷酸序列。因此，它起着增强 dna 复制保真度、 修复 dna 错配、降低基因变异和维持基因组稳定性的作用4-5。近来，mmr 系 统的研究越来越受重视，对 mmr 作用机制及该系统的组成结构与功能分析方 面的研究正不断深入6

2、-8。由于在越来越多的肿瘤(如卵巢癌、肠癌、肾癌、乳腺癌、 膀胱癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、甲状腺肿瘤等)细胞中找到 dna mmr 基因突变 或缺陷的痕迹9-11。mmr 系统与肿瘤的发生与恶化的关系成为近十年来的研究 热点，mmr 基因也成为继癌基因与抑癌基因之后被确认的第三类肿瘤相关基因 4。 外源性的持续刺激是细胞复制出现 dna 错配的重要原因之一，而日益严重 的化学污染又使生物受到的外源毒素刺激与日俱增，生物细胞内 dna 损伤与错 配几率因而也急剧增加12-15。错配的 dna 序列如果不能得到修复，将导致突变 频率增加，基因突变事件放大，最终会引起肿瘤等相关疾病的发生发展。事实上

3、， 人类 mmr 系统不仅能识别多种需要进行核苷酸切除与重新合成的 dna 错配， 还能参与如 o6-甲基鸟嘌呤和 uv 诱导的光产物等造成的 dna 损伤的修复16-19。 这说明 mmr 系统极可能参与了暴毒后 dna 损伤的修复。另有研究显示，毒物 暴露不但会使 dna 错配概率显著提高而增加 mmr 系统的负荷，而且有些致癌 物可能会直接损害 mmr 基因，使 mmr 活性降低甚至丧失。其中，feitsma 等通 过使用强致癌物乙基亚硝基脲来诱变获得 msh2、mlh1、msh6 和 pms2 等 mmr 基因缺陷型斑马鱼就是一个重要的例证20-26。因此，日益严重的环境污染 对生物及

4、人类构成的健康风险之一可能就是阻断或干扰细胞的 dna mmr 活性。 然而，目前将然而，目前将 dna mmr 活性分析与活性分析与环环境毒理学相境毒理学相结结合的研究在国合的研究在国际际上仍上仍为为空空 白，白，这这与当前与当前 dna mmr 活性分析方法活性分析方法较为较为繁繁琐琐及及环环境毒理研究境毒理研究对对所需的异源所需的异源 核酸分子的核酸分子的质质与量要求很高有关与量要求很高有关。 。 除了本课题拟开展的活细胞 dna mmr 活性分析技术以外，生物体 mmr 功能的主要分析方法还有两种。第一种是以噬菌体第一种是以噬菌体 m13mp2 及其衍生株及其衍生株为为材料材料 27-

5、30，该法利用噬菌体 m13mp2 及其一种衍生株作为材料，各自提供一条正链 ssdna 和一条负链 ssdna，这两条 ssdna 退火杂交后可形成一个带预设错配位 点的环状异源 dsdna。将这种含错配碱基的异源 dsdna 转入自身错配修复功能 缺失的宿主菌 e.coli(nr9160)，在培养平板上就会出现混合噬斑。若将这种异源 dsdna 与样本细胞提取物在体外作用后再次转化 nr9162，样本细胞的 mmr 系 统对错配位点的修复情况可通过指示板上的混合噬斑比率的变化来指示，进而 分析样本的 dna mmr 活性。第二种以寡聚核苷酸第二种以寡聚核苷酸为为材料材料31，该法采用人工合

6、 成的寡聚核苷酸来制备含有错配碱基的异源 dsdna，在错配碱基处预设特异性 限制性内酶切位点如果待测样本的 mmr 功能完整，其提取物在体外与这种异 源 dsdna 作用后，在错配碱基得到修后异源 dsdna 即变为同源 dsdna,预设的 酶切位点也就同步恢复。通过电泳检测修复后的 dsdna 的限制性酶切产物的有 无和多少来对样本 mmr 功能做定性或初步的定量分析。 这两种方法自建立后，在一定程度上促进了对 dna mmr 功能活性研究的 发展，但也都存较大的局限性。首先，这三种方法均为体外法，不能准确反应生 物体内的真实状况。其次，分析过程复杂，需要多个步骤，而且指标参数的灵敏 度和

7、准确度都较低。由于这些方法仅限于特定生物体 mmr 活性的体外分析，很 难在实际研究中广泛推广，这在一定程度上导致了国内在该研究领域力量比较 薄弱的局面。但是，复旦大学的王怡等32曾运用上述第一个方法建立了一个类似 的 dna mmr 活性体外分析模型，用以对淋巴瘤细胞的 dna mmr 活性进行分 析。 为了克服突破这些限制，美国得州大学孙鲁浙教授领衔的研究团队于 2004 年提出了一种利用绿色荧光蛋白 (enhanced green fluorescent protein，egfp)基因作为报告基因 直接对活细胞 dna mmr 活性进 行定量分析的模型33。该模型的 原理是构建一对 eg

8、fp 基因真核 表达双链核酸分子，其中一个为碱 基序列正确的同源双链核酸分子， 可以在细胞中正常地表达 egfp； 另一个为带一个错配碱基的异源 双链核酸分子，这个错配碱基设计在 egfp 基因的起始密码子处。将异源双链核 酸分子导入活细胞，如果错配没有修复，细胞就不能表达 egfp。因此，把这对 egfp 双链核酸分子平行地导入细胞中，并检测其组间的 egfp 表达率与表达强 度，就可以评估该细胞株 dna mmr 活性的强弱。绿色荧光蛋白的发明及其在 生物学研究中的应用获得 2008 年度诺贝尔奖，将其用于 dna mmr 活性的定量 检测具有显著的创新意念。但在随后的应用中，人们发现该模

9、型的异源双链核酸 分子存在一定的 egfp 本底表达(即错配未修复也有一定量的绿色荧光蛋白表达)， 原因是细胞内基因的表达并不完全依赖于起始密码子。此外，如何大量得到高纯 度核酸分子也是制约该技术应用的一个瓶颈。近来，本课题组通过与孙教授的合 作而引入此项技术。目前，本课题组已在此项技术的应用上获得了两项突破：(1) 采取无义突变策略(在 egfp 基因合适位置引入终止密码子)，建立了一种新的突 变型 egfp 表达质粒 p189，运用质粒 p111 和 p189 所获得的异源双链核酸分子 彻底消除了该模型 egfp 的本底值问题34，达到了能精确区分 mmr 活性缺失 的细胞株和正常的细胞株

10、(见插图)；(2)开发出了一种为该模型大量制备高纯度 ssdna 的技术详见前期基础，为此项技术在毒理学及其它领域的推广应用提供 了技术保障。 本项目拟在前期研究的基础上，为该 egfp 双链核酸模型再引入一个红色 荧光蛋白(red fluorescent protein, rfp)基因作为报告基因，构建一个全新的双荧 光蛋白基因双链核酸分子(含有同时可表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的基因)。 该模型的技术改进特点是：让双链核酸分子自身多带了一个 rfp 报告基因，可 直接定量指示转染效率，而当前技术需要采用与 rfp 表达质粒共转染的方法； 只需要制备一种带错配的异源核酸底物，无需再制备一种

11、无错配的同源核酸底 物；检测过程只需将异源核酸底物导入活细胞中，无需再设空白对照组和同源 核酸底物组。由此可见，新模型的思路是将所有参数在一组细胞中同时获得，而 原方法的不同参数需要在不同的细胞组中获得。因此，新模型由于所有参数完全 同步而具更的精确度与灵敏度，而且还可起到简化分析和提高效率的作用。但是，但是， 经过优经过优化的化的检测检测模型在模型在细细胞毒理学研究方面的前景如何？胞毒理学研究方面的前景如何？这这就需要就需要进进行科学与行科学与 系系统统的的验证验证与与评评估。估。 因此，本课题拟先用已知的强致癌化学污染物乙基亚硝基脲来验证该模型 应用于细胞毒性研究的适用性，再用几种已知的具

12、有 dna 突变和致癌毒性的化 学污染物(如铬(cr)、镉(cd)、砷（as）、多氯联苯(pcbs)、多环芳烃(pahs)和 ddt 等)及几种毒性较弱的新型持久性有机污染物(如全氟辛烷磺酸(pfos)、多溴二苯 醚(pbde)和双酚 a(bpa)等)来评估该模型应用于细胞毒性研究的优越性。如果如果 活活细细胞胞 mmrmmr 功能活性分析模型可以功能活性分析模型可以应应用于用于环环境毒理学研究中，我境毒理学研究中，我们们不不仅仅可可为环为环 境境污污染物的致突染物的致突变变毒性、毒性、遗传遗传毒性与致癌毒性的定量毒性与致癌毒性的定量评评价增加一个价增加一个强强有力的有力的选选 项项，更可以在

13、微，更可以在微观观上上发发掘掘环环境境污污染物生物毒性的分子机制。染物生物毒性的分子机制。 主要参考文献：主要参考文献： 1.wiesendanger, m., m.d. scharff, and w. edelmann, somatic hypermutation, transcription, and dna mismatch repair. cell, 1998. 94(4): p. 415-8. 2. gou-min li, mechanisms and functions of dna mismatch repair. cell research, 2008. 18: p. 8598

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28、ethods, 1995. 7(2): p. 187-197. 30.larson, e.d., d. nickens, and j.t. drummond, construction and characterization of mismatch-containing circular dna molecules competent for assessment of nick-directed human mismatch repair in vitro. nucleic acids res, 2002. 30(3): p. e14. 31.shimodaira, h., et al.,

29、 functional analysis of human mlh1 mutations in saccharomyces cerevisiae. nat genet, 1998. 19(4): p. 384-9. 32. 王怡等. 异源双链 dna 体外错配修复功能分析模型的构建。科学通报，2003，22（11）： p.2363-2369. 33.lei, x., y. zhu, a. tomkinson, and l-z. sun, measurement of dna mismatch repair activity in live cells. nucleic acids res, 2

30、004. 32(12): p. e100. 34. zhou, b, huang c, yang j, lu j, dong q, sun l. preparation of heteroduplex egfp plasmid for in vivo mismatch repair activity assay. anal biochem, 2009, available on line in february 26, doi:10.1016/j.ab.2009.02.020. (二二)项项目的研究内容、研究目目的研究内容、研究目标标，以及，以及拟拟解决的关解决的关键键科学科学问题问题 1研究

31、内容 (1) 双色双色荧荧光蛋白表达光蛋白表达质质粒的构建粒的构建：采用双顺反子克隆技术将 p111 和 p189 改造 成 egfp(绿色荧光蛋白)和 rfp(红色荧光蛋白)基因顺反子表达质粒 pegfp- ires-dsred 和 pmtegfp-ires-dsred，使 egfp 和 rfp 处在同一条 mrna 上同步翻译，得到的质粒 pegfp-ires-dsred 可同时表达 egfp 和 rfp，而 质粒 pmtegfp-ires-dsred 由于 egfp 基因上带有无义突变，只表达 rfp。 (2) 活活细细胞胞 dna mmr 活性双色活性双色荧荧光核酸表达分析模型的建立光

32、核酸表达分析模型的建立： ：用 pegfp- ires-dsred 获取 ssdna，与线性化的 pmtegfp-ires-dsred 退火制备带缺 刻的双荧光蛋白基因异源核酸分子，得到的双荧光蛋白基因异源核酸分子 在 egfp 基因上带有一个 t/g 错配。用上述所建立的双荧光蛋白基因异源核 酸分子转染活细胞，每一个成功转染的细胞都会表达 rfp。若该细胞具有错 配修复能力，将 t/g 错配修复后，它就会同时表达 egfp。通过流式细胞仪检 测 egfp 和 rfp 表达情况，即可分析活细胞内的 dna mmr 活性。 (3) 新模型新模型应应用于用于细细胞毒理学研究的适用性研究胞毒理学研究

33、的适用性研究：先用已知的强致癌化学污染物 乙基亚硝基脲(具有 mmr 基因突变毒性)来验证上述建立的活细胞 dna mmr 活性检测新模型是否可以应用于细胞毒理学的研究。然后，再用已知 的具有 dna 突变和致癌毒性的化学污染物(如 cd、as、pcbs、pahs、ddt 等)以及毒性较低且致癌效应不明的新型污染物(如 pfos、pbde、bpa 等)来 评估该模型应用于细胞毒理学研究的优越性。 2研究目标： ：通过以上研究内容的实施，本课题将在建立活细胞 dna mmr 活 性分析新模型的基础上，验证与评估该项技术应用于细胞毒理学研究的前景 与优越性。这不仅可为化学污染物的致突变毒性、遗传毒

34、性和致癌毒性的定 量评价提供一种新方法，而且还具有推广到癌症发病机制研究等领域的前景， 以及在微观上发掘环境污染物生物毒性的分子机制。 3拟解决的关键问题 (1) 本项目拟构建的双色荧光蛋白表达质粒在表达 egfp 基因与 rfp 基因时，两 者必须同步，但又相对独立，一方的表达不会抑制或增强另一方的表达，即 两个基因在表达时相互间不会出现拮抗或协同效应。因此，成功构建符合上 述要求的双色荧光蛋白表达质粒是本项目的一个关键所在。 (2) 如果确认本项目建立的活细胞 dna mmr 活性分析新模型在细胞毒理学研 究中具有应用前景，这必将为环境毒物致癌与致突变毒性的定量评价开辟一 条新途径。此外，

35、由于 dna mmr 活性是许多肿瘤疾病发生与发展的诱因， 该模型的建立与应用必然可以促进环境污染与疾病发生内在关联研究的进 步。 (三三)拟拟采取的研究方案及可行性分析采取的研究方案及可行性分析 1研究方案 (1) 双色双色荧荧光蛋白表达光蛋白表达质质粒的构建粒的构建： 实验材料：egfp 正常表达型质粒 p111、无义突变型 egfp 质粒 p189、双顺 反子表达载体 pires2-dsred(clontech)、pfu 高保真 dna 聚合酶、t4 dna 连接酶、dpni 内切酶、dntps(脱氧核糖核苷酸)和引物等。 以 pires2dsred 载体为摸板，设计引物，扩增出含 ir

36、es 表达元件的 rfp 基因片段 ires-dsred，对 ires-dsred 片段进行双酶切与纯化。 对质粒 p111 和 p189 分别进行双酶切，回收大片段。然后，分别放到两个无 菌的 1.5ml ep 管中，按照 1：3 的摩尔比例加入双酶切并纯化后的 ires- dsred 基因片段，再加入 t4 dna 连接酶，16过夜温育进行连接反应。 从两管连接产物中各取 10ng 分别转染 e.coli jm109 感受态细菌，涂布 lb 上选择平板，37过夜培养，筛选长出的单菌落。 将单菌落分别接种于 lb 液体培养基中，37下震荡培养 12 小时，提取质 粒。酶切电泳鉴定后，再测序鉴

37、定，并转染细胞验证。 最终获得两种双荧光蛋白表达质粒，即由 p111 衍生而来的 pegfp-ires- dsred(带有野生型的 egfp 基因和 rfp 基因，能在细胞中同时表达产生 红绿两种荧光)和由 p189 衍生而来的 pmtegfp-ires-dsred(带有无义突 变型的 egfp 基因和野生型 rfp 基因，在细胞内只能表达产生红色荧光)。 (2) 活活细细胞胞 dna mmr 活性双色活性双色荧荧光核酸表达分析模型的建立光核酸表达分析模型的建立： 实验材料：步骤(1)中构建的双荧光质粒 pegfp-ires-dsred 和 pmtegfp- ires-dsred、缺刻酶 nb

38、.bpu10i、限制性内切酶 bstxi、外切核酸酶 exonuclease、质粒安全性酶 psad(epicentre 公司产品)等生化试剂。 以质粒 pegfp-ires-dsred 为底物，用缺刻酶 nb.bpu10i 充分酶切，使其 模板链(“”链)上出现若干缺刻，紧接着用外切核酸酶 exonuclease完全 消化，使其模板链(“”链)完全水解，纯化回收后得到单链环状的 pegfp- ires-dsred 编码股(“”链)dna。 以质粒 pmtegfp-ires-dsred 为底物，用限制性内切酶 bstxi 充分酶切，使 其完全变成线性化分子，浓缩回收。 将上述中得到的单链环状的

39、 pegfp-ires-dsred 编码股(“”链)dna 分 子与中得到的双链线性的 pmtegfp-ires-dsred 分子按照 1.5:1 摩尔 比混合置于 0.2ml pcr 管中，在 pcr 仪中 95高温变性 5 分钟。取出反 应管，室温下自然冷却。冷却反应管中将产生单链环状的 pegfp-ires- dsred 编码股(“”链)dna 分子与双链线性的 pmtegfp-ires-dsred 分 子中的模板链(“”链)退火杂交形成的带一个缺刻的环状异源双链核酸 分子。 于反应管中加入 psad 酶，降解去除多余单链分子和双链线性分子，纯化 回收后得到高纯度的含双荧光蛋白表达基因的

40、缺刻环状异源双链核酸分 子，该核酸分子上的 egfp 基因上将存在一个引入的 t/g 错配。 将中得到的核酸分子分别转染 mmr 活性正常细胞株(如 hela)和 mmr 活性缺失细胞株(如 rko 或 hct116)。用流式细胞仪分析产生红色和绿色 荧光的细胞数量及荧光强度，即可用下列公式来定量各株细胞的 dna mmr 活性： a = g gm/r rm 式中 a 为细胞株 dna mmr 活性，g 为能表达绿色荧光蛋白的细胞数， gm为细胞表达绿色荧光蛋白的平均强度，r 为能表达红色荧光蛋白的细 胞数，rm为细胞表达红色荧光蛋白的平均强度。这是因为 mmr 活性正 常或缺失的细胞株均会表

41、达红色荧光蛋白，因而红色荧光蛋白的表达率 与表达强度即可代表转染较率，但只有具错配修复能力的细胞可表达绿 色荧光。因此，绿色荧光蛋白表达值与红色荧光蛋白表达值的比值可用于 表达细胞的 dna mmr 活性。 (3) 新模型新模型应应用于用于细细胞毒理学研究的适用性研究胞毒理学研究的适用性研究： 细胞系：dna mmr 活性正常的细胞 hela、sw480 和 mda-mb-231。 化学污染物：乙基亚硝基脲、cd、pcbs、ddt、pbde、pfos 等。 毒物工作液配置：溶于 dmso 和去离子超纯水中，配成 10 mm 的工作母液， -20下保存。使用时，将母液用细胞培养液稀释成各种浓度（

42、浓度范围视 毒物的毒性而定）的工作液，并用 dmso 调整工作液中的 dmso 浓度，使 其含量均为 0.1，dmso 对照液的 dmso 浓度也为 0.1。 细胞培养与暴毒：细胞复苏后用 dmem 培养基加 10%胎牛血清培养 12 周，传代。将不同浓度的毒物工作液、dmso 对照液和空白对照液分别添 加至细胞培养基中，持续暴毒传代至第三或第四代。 转染：采用脂质体介导法将双荧光蛋白异源核酸分子分别导入各组细胞， 培养 24 小时。 检测：在荧光显微镜下观察红色与绿色荧光的表达情况，拍照记录。然后， 将细胞用胰酶消化，制成细胞悬液后，取样进流式细胞仪检测(每组进样 30000 个细胞)，获得

43、红色与绿色荧光表达的细胞数和荧光平均强度等参数。 按照上述公式a = g gm/r rm计算暴毒组、dmso 对照组和空白对照 组的 dna mmr 活性，即可分析所测化学污染物是否具 dna mmr 功能 干扰效应。 2技术路线 3可行性分析 (1) 在前期基在前期基础础方面方面，活细胞 dna mmr 活性检测技术是本项目组主要成员孙 鲁浙教授及其所属研究团队创建的( 见见参考文献参考文献 34)。近来，申请者带领项目 组建立一个新质粒 p189，彻底消除了原模型 egfp 本底值过高的问题( 见见参参 考文献考文献 35)，而且也在高纯度核酸分子大量制备技术上取得了突破性的进展。 此外，以细胞和斑马鱼作为模式生物的环境毒理学研究是本团队近期的研究 重点。这些均为完成本项目的研究内容打下了坚实的基础。 (2) 在技在技术术上上，拟采用近年来发展起来的双顺反子克隆技术来构建双色荧光蛋白 表达质粒，即将 egfp 基因和 rfp 基因通过 ires（内部核糖体进入位点）表 达元件连接起来，置于一个共同的启动子下，使 egfp 基因和 rfp 基因在同