HBVHCV高精度核酸检测技术的临床意义

1、.,肝炎病毒PCR检测技术国内现状及最新进展 暨HBV/HCV高精度核酸检测技术的临床意义,.,主要内容,Part 荧光定量PCR技术简介 Part HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 Part 临床对HBV/HCV检测技术的需求 Part HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义,.,Part PCR技术简介,.,病原学检测常用的实验室技术 细胞培养与鉴定（“金标准”）、动物实验 血清学、免疫学诊断技术 电镜技术 分子生物学诊断技术PCR,PCR技术简介,.,多聚酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction),Polymerase: DNA聚合酶,PCR

2、技术简介,.,核裂变链式反应,“链式反应”改变世界,PCR技术简介,.,PCR技术的诞生,Kary B. Mullis（穆利斯（美）,1971：Khorana等提出在体外经DNA变性、引物 杂交,再用DNA聚合酶延伸DNA的设想。 1983：Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 1988：耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 1993：Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,PCR技术简介,.,Kary B. Mullis（1944）,http:/,The New York Times as highly original and significant,

3、virtually dividing biology into the two epochs of before P.C.R. and after P.C.R.,PCR技术简介,.,PCR技术简介,PCR原理：实质就是体外基因复制技术,.,PCR技术简介,30次循环后靶序列扩增的数量,10亿,.,PCR技术分类,常规PCR 在PCR结束后对终点产物进行分析。 巢式PCR 多重PCR PCR结合限制性长度多态性分析（PCR-RFLP） PCR结合特异性寡合苷酸探针斑点杂交（PCR-ASO） PCR结合变性梯度凝胶（PCR-DGGE） PCR结合的单链构象多态性（PCR-SSCP）等分析技术,荧光

4、定量 PCR（real-time PCR) 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标 记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。 实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。,PCR技术简介,.,荧光定量实时PCR与普通PCR的比较 实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控,能够实时地观察到产物的增加,直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提高了PCR反应的特异性 增加定量的精确性 全程监控,准确的算法进行定量 结果分析更加快捷方便,无需跑胶,PCR技术简介,.,1、目

5、的基因的克隆： PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法。 2、基因的体外突变： 可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。,PCR的应用,3、DNA和RNA的微量分析： PCR技术高度敏感，对模板的含量要求很低，是DNA和NA微量分析的最好方法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。 4、基因转录水平检测 RT-PCR可检测不同组织或细胞中基因的转录水平 5、基因突变分析： 利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。,PCR技术简介,.,Part HBV/

6、HCV核酸检测技术现状及进展,.,HBV/HCV核酸检测技术现状及进展,乙型肝炎检测标志物 HBsAg, 抗-HBs, HBeAG,抗-HBe, 抗-HBc（IgG,IgM）, HBV-DNA,.,HBV/HCV核酸检测技术现状及进展,., 免疫学检测 生物化学检测 组织学检测 分子生物学检测 基因芯片,乙肝病毒的检测方法,HBV/HCV核酸检测技术现状及进展,.,HBV/HCV核酸检测技术现状及进展,HBV分子生物学检测 HBV-DNA 基因耐药突变检测 基因分型 HBVcccDNA HBV前C及核心启动子变异,.,HBV/HCV核酸检测技术现状及进展,HBV分子生物学检测方法及临床意义,.

7、,HBV/HCV核酸检测技术现状及进展,HBV分子生物学检测方法及临床意义,.,HCV的感染模型,HBV/HCV核酸检测技术现状及进展,.,丙肝病毒的检测方法, 血清生化学检测 HCV抗体检测 HCV核心抗原检测 HCV RNA 检测,HBV/HCV核酸检测技术现状及进展,.,HCV分子生物学检测方法及临床意义,HBV/HCV核酸检测技术现状及进展,.,目前国内外乙肝主流基因诊断技术比较,除个别公司产品外，国内的检测技术在方法学、灵敏度以及准确性方面一般都远远落后于发达国家,HBV/HCV核酸检测技术现状及进展,.,常用DNA类标本处理方法,HBV/HCV核酸检测技术现状及进展,.,常用RNA

8、类标本处理方法,HBV/HCV核酸检测技术现状及进展,.,高灵敏度的磁珠核酸纯化方法的比较,HBV/HCV核酸检测技术现状及进展,.,（圣湘）磁珠法HBV产品与国内外主流产品的比较,HBV/HCV核酸检测技术现状及进展,.,圣湘磁珠法HCV产品与国内外主流产品的比较,25 IU/ml,HBV/HCV核酸检测技术现状及进展,.,不同方法的HBV DNA检测下限以及不同标准要求,HBV/HCV核酸检测技术现状及进展,.,国内大部分检测试剂灵敏度1000Copies/ml，特异性、准确性等方 也存在着严重缺陷，远远不能满足临床检测和用药监控的需求，这也是国内HCV研究进展缓慢的重要原因之一。,HBV

9、/HCV核酸检测技术现状及进展,.,Part 临床对HBV/HCV检测技术的需求,.,“2008年美国肝病协会CHB防治指南”：持久消除HBV是乙肝的治疗终点，HBV DNA病毒载量尽可能小于或等于10 IU/ ml。,临床对HBV/HCV检测技术的需求,.,“欧洲肝病研究学会EASL2010年指南”指出：采用荧光实时PCR方法检测HBV DNA时，其灵敏度要小于或等于10-15 IU/ ml。,临床对HBV/HCV检测技术的需求,.,“欧洲肝病研究学会EASL2011指南”还指出：丙肝患者治疗的终点是HCV RNA病毒载量低于50 IU/ ml。,临床对HBV/HCV检测技术的需求,.,研究

10、表明国产PCR试剂的灵敏度很难达到上述要求,五种乙型肝炎病毒核酸荧光定量检测试剂盒的比较,中华传染病杂志，2009年 第3期 吴星,黄维金, 周诚 ,庄辉 等(中国药品生物制品检定所,北京大学医学部),临床对HBV/HCV检测技术的需求,.,国内行业指导原则,国家SFDA技术审评中心HBV DNA定量试剂技术审评指导原则中指出： HBV DNA最低检测限应 30IU/ml,临床对HBV/HCV检测技术的需求,.,国产很多乙肝PCR试剂的灵敏度为500IU/ml至1000IU/ml之间，丙肝试剂的灵敏度为在1000IU/ml以上。 从病毒性肝炎的早期诊断及适时确定治疗终点的临床需求看，现有的国产

11、PCR试剂需要提高检测灵敏度。,国内现状,临床对HBV/HCV检测技术的需求,.,Part HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义,.,HBV DNA基线水平较高增加肝硬化和肝癌的风险,HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义,.,持续高HBV DNA水平和肝癌发病增加相关,HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义,.,高HBV DNA水平预示长期肝相关死亡率风险,HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义,.,乙肝的治疗,慢性乙肝的诊断 1. HBsAg持续阳性6个月以上 2. HBV-DNA高于105拷贝/毫升 3. ALT持续升高或反复升高 慢性乙肝的分类

12、 1. HBeAg阳性乙肝：HBsAg、HBeAg阳性； HBV-DNA高于105拷贝/毫升；ALT持续升高或反复升高 2. HBeAg阴性乙肝：HBsAg、anti-HBe阳性； HBV-DNA高于104拷贝/毫升；ALT持续升高或反复升高 慢性乙肝治疗的目标 病毒抑制：表现为HBeAg血清转换和HBV-DNA阴转 肝损伤程度降低：表现为转氨酶恢复正常 完全清除病毒：表现为HBsAg消失，HBsAb出现，血清和肝细胞中检测不到HBV-DNA，从目前水平来看，不可能完全清除病毒,HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义,.,临床检测HBV DNA启动抗病毒治疗，连续定量HBV DNA是

13、病人治疗前评估的关键！,HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义,.,ALT：谷丙氨酸转氨酶 ULN：正常值的上限 LT：肝移植,慢性乙型肝炎HBeAg阳性病人治疗指南（亚太肝病研究会2008年）,HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义,.,慢性乙型肝炎HBeAg阴性病人治疗指南,HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义,.,慢性乙型肝炎肝硬化病人治疗指南,ETV：恩替卡韦 LAM：拉米夫定 Ldt：替比夫定 ADV：阿德福韦,HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义,.,上图为采用罗氏公司Cobas TaqmanAmplicor HBV DNA定量PCR试剂时治疗路线图,替比夫定治疗慢性乙型肝炎中国路线图,HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义,.,部分HBV DNA定量试剂检测性能比较,HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义,.,注：检出限为100Copies/ml,慢性丙肝治疗建议 由亚太地区肝病学会（APASL）、美国国立卫生研究院（NIH）、欧洲肝病学会（EASL）等发表的有关丙型肝炎的诊疗指南或专家共识中指出：目前对丙肝最有效的治疗是聚乙二醇化干扰素联合利巴韦林。,治疗应答的定义及描述,HBV/HCV高