大肠杆菌内源过氧化氢检测方法的建立毕业论文

1、论文题目：论文题目：大肠杆菌内源过氧化氢检测方法的建立大肠杆菌内源过氧化氢检测方法的建立 学院及专业：学院及专业：食品与生物工程学院食品与生物工程学院 食科食科 摘摘要要 本实验旨在通过物理、化学方法的对比及探索改进，找出一种检测细菌內源 过氧化氢的模型方法。 本实验以大肠杆菌突变体为研究对象，首先以 30%的 h2o2为研究对象，确定 其原液的浓度，然后通过辣根过氧化物酶 酚红法、荧光法、硫酸钛法三种不 同方法绘制出不同的标准曲线，最后根据不同的标准曲线计算出20 个大肠 杆菌抗氧化基因突变体菌株在同一生长时期时內源过氧化氢的释放量。 结果显示：30%的 h2o2原液浓度为 6.9m，三种检

2、测方法绘制出来的标准曲线 的线性相关系数分别是 0.9963、0.9936、0.997，根据辣根过氧化物酶 酚红 法和荧光法不同的线性关系计算出来不同菌株h2o2的释放量都有明显的差异， 范围在 1m10m 之间。硫酸钛法的检测区间在 10m500m 之间，明显检 测不到大肠杆菌抗氧化基因突变体菌株中內源过氧化氢的释放量。 通过分析对比发现三种方法中辣根过氧化物酶 酚红法和荧光法都可以检 测到大肠杆菌抗氧化基因突变体菌株中內源过氧化氢的释放量，硫酸钛法检测 不到，但是辣根过氧化物酶 酚红法比较繁琐且需要严格控制反应条件，而 荧光法的灵敏度比较高，操作也比较简单方便。 关关 键键 词：词：內源过

3、氧化氢，检测方法，大肠杆菌，突变体 subject: measure assays establishment of endogenous hydrogen peroxide in escherichia coli college and specialty: college of food 8.5u/ml）), 氢氧化钠（1m，10ul） ，大肠杆菌各种突变体（如下表） 标号标号突变体突变体标号标号突变体突变体标号标号突变体突变体标号标号突变体突变体 1 2 3 4 5 as240 as291 as356 as396 as290 6 7 8 9 10 mc4100 mc4100ahp:kan

4、 gs022 lc70 lc74 11 12 13 14 15 ji360 ji361 ji362 ji367 ji370 16 17 18 19 20 ji372 ji374 ji377 ab1157 mg1655 3.1.2 仪器仪器 酸度计，水浴锅，超净工作台，722s 可见分光光度计，tgl-18c 型高速台式 离心机，chas 气浴恒温振荡器，ldzx-50kb 立式压力蒸汽灭菌器 3.1.3 溶液的配制溶液的配制 配制 40mm 的 nacl、ph=7.0 10mm 的磷酸钾溶液、0.1g/l 酚红溶液和 hrpo;8.5u/ml 辣根过氧化物酶, 1m，10ul 的氢氧化钠溶液，

5、1m 的盐酸溶液。 注：氯化钠，磷酸钾溶液和酚红溶液一次各配注：氯化钠，磷酸钾溶液和酚红溶液一次各配 500ml 备用，辣根过氧化物酶在使用前加入。备用，辣根过氧化物酶在使用前加入。 3.1.4 实验方法实验方法 使用缓冲液配制酚红-过氧化物酶试剂，包含 nacl(40mm)、磷酸钾（ph=7.0 10mm） 、酚红（0.1g/l）和辣根过氧化物酶（hrpo;8.5u/ml）,使用前加入酚红和 hrpo 到缓冲液中。每 1.0ml 酚红试剂加入 0.5ml 样品溶液，h2o2标准液也类似 处理，混匀并 25保温 5 分钟，加入氢氧化钠（1m，10ul）使溶液 ph 为 12.5 并 且有稳定染

6、色，当测定大肠杆菌內源过氧化氢含量时，要先离心，去上清液，然 后用无菌水重悬，放置 10min，再按 2:：1 与缓冲液混匀。水浴后，调 ph 时，用 对照调，然后每个样品按比例加入氢氧化钠，确保每个样品中氢氧化钠含量相同， 在可见分光光度计下测 a610。 3.1.4.1.确定酚红法测定时的上下限确定酚红法测定时的上下限 将过氧化氢原液按梯度稀释：100mm，10 mm，1 mm，0.1 mm，0.01 mm，0.001 mm，并测其吸光值（a610） 。确定上下限（见表 3-1） 3.1.4.2 用普通酚红法制标准曲线用普通酚红法制标准曲线 在上下限之间稀释几个浓度梯度，并在可见分光光度计

7、下测其吸光值 （a610） 。 （见表 3-2 和图 3-3） 3.1.4.2 用改进酚红法制标准曲线用改进酚红法制标准曲线 在上下限之间稀释几个浓度梯度，并在可见分光光度计下测其吸光值 （a610） 。 （见表 3-4 和 3-5） 3.1.4.3 普通的酚红法测定样品中內源过氧化氢普通的酚红法测定样品中內源过氧化氢 原始菌体使用无菌水重悬，然后和甘油按比例混匀，冰箱冷冻保存。在 lb 培养基上接种后 37振荡培养，12 小时后看菌体的生长情况开始下一步实验。 菌体培养好后，将各突变体的菌悬液调至吸光值为 1.070 左右的统一浓度，调好 后，菌悬液在 3500 转转速下离心 10min，去

8、上清，用无菌水重悬，然后离心除去 菌体，上清中加酚红-过氧化物酶试剂，然后按比例每 1.0ml 酚红试剂加入 0.5ml 样品溶液，混匀并 25保温 5 分钟，加入氢氧化钠（1m，10ul）使溶液 ph 为 12.5 并且有稳定染色，测定上清在 a610 条件下的吸光值。 （见表 3-6） 3.1.4.4 改进的酚红法测定样品中內源过氧化氢改进的酚红法测定样品中內源过氧化氢 菌体培养好后，将各突变体的菌悬液调至吸光值为 1.070 左右的统一浓度， 调好后，菌悬液在 3500 转转速下离心 10min，去上清，用无菌水重悬，振荡 2min，再放置 10min 后，加酚红-过氧化物酶试剂，然后按

9、比例每 1.0ml 酚红试剂 加入 0.5ml 样品溶液，混匀并 25保温 5 分钟，加入氢氧化钠（1m，10ul）使溶 液 ph 为 12.5 并且有稳定染色（调 ph 时用标准液对空白进行，记下调至 12.5 时 需要的氢氧化钠的量，对其它样品按相同比例加入氢氧化钠溶液） ，然后离心除 去菌体，测定上清在 a610 条件下的吸光值（见表 3-7） 3.2 实验结果实验结果 表表 3-1 不同浓度梯度的过氧化氢原液在不同浓度梯度的过氧化氢原液在 610nm 处的吸光值处的吸光值 table 3-1 a610 of different concentration gradient stock

10、solution of hydrogen peroxide 梯度梯度100m 10m 1m100m10m1m 吸光值吸光值 吸光值吸光值 平均值平均值 1.697 1.640 1.667 2.010 1.921 1.966 1.959 1.963 1.961 0.408 0.669 0.539 0.080 0.085 0.083 0.006 0.002 0.004 该表显示出酚红法的检测下限低，浓度为 1m 时能测量出。 表表 3-2 不同浓度梯度的过氧化氢原液在不同浓度梯度的过氧化氢原液在 610nm 处的吸光值处的吸光值 table 3-2 a610 of different concen

11、tration gradient stock solution of hydrogen peroxide 500m100 m 80m60 m 40m20m 1.6250.50 0 0.4210.34 9 0.2590.152 该表显示出浓度在 500m 和 20m 之间时吸光值成线性关系。 20406080100 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 y=0.0043x+0.0788 r 2=0.9937 图图 3-3 20 至至 100m 浓度梯度的过氧化氢标准曲线浓度梯度的过氧化氢标准曲线 fig. 3-3 the standa

12、rd curve of hydrogen peroxide at concentration gradient from 20 to 100m 表表 3-4 不同浓度梯度的过氧化氢原液不同浓度梯度的过氧化氢原液 610nm 下的吸光值下的吸光值 table 3-4 a610 of different concentration gradient stock solution of hydrogen peroxide 该表显示出浓度在 100m和 1m之间时吸光值成线性关系。 在上下限之间取 7 个浓度梯度，测吸光值 020406080100 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.

13、6 0.7 y=0.0059x+0.0108 r2=0.9971 图图 3-5 0-100m 浓度梯度的吸光值作标准曲线浓度梯度的吸光值作标准曲线 fig. 3-5 the standard curve of concentration gradient from 0 to 100m 浓度浓度 梯度梯度 100m80m60m40m20m10m1m 吸光吸光 值值 0.6080.4610.3750.2480.1340.0570.022 表表 3-6 普通酚红法测定样品中內源过氧化氢普通酚红法测定样品中內源过氧化氢 table 3-6 common determination of phenol

14、red endogenous hydrogen peroxide in the sample a a610 610 h h2 2o o2 2的释放量（的释放量（mm）大肠杆菌菌种大肠杆菌菌种a a420 420( (稀 稀 释前释前) ) a a420 420( (稀 稀 释后释后) ) 平行平行 1 1平行平行 2 2平行平行 1 1平行平行 2 2 as240 1.6251.0800.0180.0191.761.93 as291 1.7471.0780.0150.0131.250.92 as356 1.8251.0790.0090.0130.240.92 as396 1.8391.0760

15、.0220.0212.442.27 as290 1.8181.0740.0220.0202.442.1 mc4100 1.6741.0720.0190.0151.931.25 mc4100 ahp:kan 1.6931.0810.0110.0120.580.75 gs022 1.9761.0810.0170.0191.591.93 lc70 1.5511.0720.0240.0212.782.27 lc74 1.1841.0700.0190.0191.931.93 ji360 1.6361.0730.0050.004-0.4-0.6 ji361 1.8341.0700.0090.0110.24

16、0.58 ji362 1.9901.0720.0250.0282.953.46 ji367 1.1641.0710.0340.0364.474.81 ji370 1.5271.0720.0320.0324.144.14 ji372 1.5421.0720.0330.0324.314.14 ji374 1.3051.0760.0270.0293.293.63 ji377 1.1961.0750.0260.0273.123.29 ab1157 1.3171.0690.0190.0201.932.1 mg1655 1.3451.0700.0230.0232.612.61 注：注： 代表负值，即內源过

17、氧化氢的量不在硫酸钛法的测量范围内代表负值，即內源过氧化氢的量不在硫酸钛法的测量范围内 表表 3-7 改进酚红法测定样品中內源过氧化氢改进酚红法测定样品中內源过氧化氢 table 3-7 the improved phenol red method for determining endogenous hydrogen peroxide in samples 菌体菌体 标号标号 重悬后未离心重悬后未离心 a610 重悬后离心重悬后离心 a610 大肠杆菌內源过氧化氢含量大肠杆菌內源过氧化氢含量 （m） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0.216 0.239 0.305 0.228 0

18、.268 0.099 0.134 0.217 0.281 0.180 0.057 0.038 0.035 0.038 0.022 0.071 0.061 0.035 0.073 0.063 7.831 4.610 4.102 4.610 1.898 10.203 8.508 4.102 10.542 8.847 12345678910 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 0 2 4 6 8 10 12 14 m 图图 3-8 酚红法测大肠杆菌內源过氧化氢的含量酚红法测大肠杆菌內源过氧化氢的含量 fig. 3-8 determine the content of endo

19、genous hydrogen peroxide in escherichia coli using phenol red method 3.3 结果分析结果分析 （1）由表 3-1 和 3-2 知上限为 100m 左右，下限为 1m 左右。 （2）由表 3-3 和表 3-5 知，普通酚红法做出的标准曲线线性很好，改进的酚 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 0.318 0.236 0.281 0.173 0.286 0.306 0.221 0.192 0.143 0.252 0.072 0.019 0.081 0.029 0.036 0.021 0.020 0.023

20、 0.098 0.029 10.373 1.390 11.898 3.084 4.271 1.729 1.559 2.068 14.780 3.085 红法做出的标准曲线比普通酚红法更精确。 （3）由表 3-6 知，不同的大肠杆菌突变体菌株释放 h2o2的能力是不同的，与 野生型菌株 mg1655 相比，都有明显的增加或者减少，这说明对于不同的基因突 变体来说，基因突变对 h2o2的释放量是有影响的。用普通酚红法测量內源过氧化 氢时，由于內源过氧化氢的量较低，不能测出来。数据结果偏小，数据不太稳定， 有负值的情况，原因可能是方法有问题和菌悬液稀释时没有稀释到统一的精确浓 度，菌悬液离心重悬，重

21、悬的时间短，过氧化氢还没有进入重悬水中，所以测得 的过氧化氢吸光值偏低，即浓度偏低，针对这些问题，对辣根过氧化物酶酚红法 进行改进，并在稀释菌悬液时尽可能将其稀释到固定的统一吸光值。 （4）由表 3-7 知，改进酚红法可以测得突变体內源过氧化氢的量。说明菌体 中过氧化氢的量不易释放到外面，重悬离心后震荡有助于过氧化氢的释放，并且 重悬后没有离心除去菌体时吸光值比离心除去菌体时吸光值大。这说明，当测吸 光值时，菌体能影响测得的结果。 第第 4 章章 荧光法测定大肠杆菌內源过氧化氢荧光法测定大肠杆菌內源过氧化氢 4.1 材料和方法材料和方法 4.1.1 试剂试剂 ar，二甲基亚砜，磷酸钾溶液（ph

22、=7.8） ，辣根过氧化物酶，30%过氧化氢 4.1.2 仪器仪器 722s 可见分光光度计，tgl-18c 型高速台式离心机，chas 气浴恒温振荡器， ldzx-50kb 立式压力蒸汽灭菌器，hitachi f-4500 型荧光光谱仪，超净工作台。 4.1.3 溶液配制溶液配制 ar 溶液：1mg 的 ar 溶解在 0.78ml 的二甲基亚砜中，取 0.75ml 该溶液至 18ml 的 50mm 的磷酸钾溶液中（ph=7.8） hrp 溶液：hrp 溶解于 50mm 的磷酸钾溶液中（ph=7.8） ，配成浓度为 0.02mg/l 的溶液。 4.1.44.1.4 实验方法实验方法 4.1.4

23、.14.1.4.1 标准曲线的制作标准曲线的制作 （1）配制不同浓度梯度的过氧化氢标准液，梯度为 100m，40m，20m，10m，1m （2）用荧光光谱仪扫描出最大激发波长为525nm和最大发射波长595nm，在 最大发射波长时测上述浓度梯度的过氧化氢标准液的荧光强度 （3）在大致的线性范围内配不同的浓度梯度的过氧化氢标准液，测其荧光 强度。 （4）根据结果绘制标准曲线 4.1.4.24.1.4.2 荧光法测突变体內源过氧化氢荧光法测突变体內源过氧化氢 0.45ml样品与0.25ml的hrp溶液和0.25ml的ar溶液混合，然后在最大发射波 长时测上述浓度梯度的过氧化氢标准液的荧光强度。 4

24、.24.2 实验结果实验结果 对浓度梯度为100m，40m，20m，10m，1m的过氧化氢标准液进行荧光光 谱分析，结果有两个最大激发波长，525nm和256nm，最大发射波长为595nm。 表表4-14-1 浓度梯度梯度为浓度梯度梯度为1 1m100100m的过氧化氢标准液荧光强度的过氧化氢标准液荧光强度 tabletable 4-14-1 thethe fluorescencefluorescence intensityintensity ofof concentrationconcentration gradientgradient forfor 1 1m m 100100m m hyd

25、rogenhydrogen peroxideperoxide standardstandard solutionsolution 浓度梯度浓度梯度100m40m20m10m1m 荧光强度荧光强度9921773065045790 该表显示1m到100m之间不成线性关系 表表4-24-2 浓度梯度为浓度梯度为0.80.8m m10m m的过氧化氢标准溶液测得其荧光强度的过氧化氢标准溶液测得其荧光强度 tabletable 4-24-2 thethe fluorescencefluorescence intensityintensity ofof concentrationconcentration

26、 gradientgradient forfor 1 1m m 100100m m hydrogenhydrogen peroxideperoxide standardstandard solutionsolution 浓度梯度浓度梯度10m 8m6m4m2m1m0.8m 荧光强度荧光强度32601146976656385256220 该表显示0.8m到8m之间成线性关系，浓度在10m时线性很差 0123456789 200 400 600 800 1000 1200 y=132.64x+124.58 r 2=0.9936 图图4-34-3荧光法标准曲线荧光法标准曲线 fig.4-3fig.4

27、-3 thethe fluorescencefluorescence methodmethod standardstandard curvecurve 表表4-44-4 用荧光法在发射波长为用荧光法在发射波长为591nm591nm测突变体的內源过氧化氢测突变体的內源过氧化氢 tabletable 4-44-4 measuremeasure mutantmutants s endogenousendogenous hydrogenhydrogen peroxideperoxide atat emissionemission wavelengthwavelength 591nm591nm usin

28、gusing fluorescencefluorescence methodmethod 菌体标号菌体标号离心重悬后用荧光法测得荧光离心重悬后用荧光法测得荧光 强度值强度值 算出突变体內源过氧化氢的含算出突变体內源过氧化氢的含 量量 y=132.64x+124.58 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1181 971 740 665 596 918 1116 1046 1013 907 1047 935 742 1030 867 841 850 750 705 681 7.965 6.381 4.640 4.074 3.554

29、 5.982 7.475 6.947 6.698 5.898 6.954 6.110 4.655 6.826 5.597 5.401 5.470 4.715 4.376 4.195 12345678910 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 m 图图 4-5 不同大肠杆菌菌株內源过氧化氢含量柱状图不同大肠杆菌菌株內源过氧化氢含量柱状图 fig. 4-5 different e es sc ch he er ri ic ch hi ia a coli strains endogenous hydrogen peroxide cont

30、ent bar chart 4.3 结果分析结果分析 （1）在 595nm 下荧光强度最强，所测得的荧光强度灵敏度最高。 （2）由表 4-2 知，浓度梯度梯度为 100m，40m，20m，10m，1m 时荧光 强度不成线性关系。由于荧光法灵敏度高，在高浓度时容易发生簇变，使荧光强 度变弱。 （3）由表 4-2 和表 4-3 知，当浓度很低时，在浓度梯度为 10m，8m，6m，4m，2m，1m，0.8m 时，荧光强度成线性，且线性很好。 （4）由表 4-4 知，由于不同突变体的生长速度不同，用荧光法对不同突变 体的过氧化氢水平进行定量检测，结果显示，不同突变体过氧化氢含量有明显差 别。如上表 a

31、s240 突变体內源过氧化氢浓度最大，as290 突变体內源过氧化氢浓 度最大。 第第 5 章章 结论结论 （1）h2o2极不稳定，见光后易发生分解，所以一般情况下要用棕色试剂瓶 避光保存，以免造成结果的不准确，我们在确定 h2o2原液浓度时，发现它的检 测出来的浓度比实际浓度要低，这可能有以下几个原因：a.过氧化氢在运输过程 中没有避光保存造成的；b.放置时间较长 c.实验操作过程中见光分解造成的。 （2）硫酸钛法检测过氧化氢时，检测范围区间在 10m100m 之间，而大 肠杆菌內源过氧化氢的释放量在 10m 以下，所以无法检测出来。因此，使用硫 酸钛法检测內源过氧化氢时有局限性，不能对低浓

32、度的內源过氧化氢进行检测。 （3）因为细菌释放的 h2o2大多数在细胞壁上，有一部分在培养基中，所以 我们对实验方案进行了调整，离心后和辣根过氧化物酶-酚红试剂反应，水浴后 加入氢氧化钠终止反应，然后离心用上清测 a610。这样辣根过氧化物酶-酚红试 剂可以与细胞壁上的 h2o2充分反应也避免了培养基对实验结果的影响。 （4）荧光法具有很高的灵敏性，且当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与 该物质的浓度通常会有良好的正比关系。根据辣根过氧化物酶酚红法测得的实 验数据可以看出大肠杆菌内源 h2o2的释放量大约在 10m 以下，所以我们在大 肠杆菌内源 h2o2的释放量附近做了一组浓度梯度，发现荧光

33、强度与浓度之间有 很好的线性关系。荧光法检测过氧化氢的一个最大的优点就是灵敏度比较高而且 操作也比较简单。 （5）通过酚红法和荧光法的对比，60%突变体的內源过氧化氢含量使用两种 方法测量时差别不大，在 1-2m 左右（如编号为 1、2、3、4、7、8、9、10、15、20 的突变株），其它的由于实验误差的存在， 內源过氧化氢的含量有些差别，但总的来说，无论是高还是低，使用两种方法测 得內源过氧化氢含量时总的趋势是相同的。这说明不同的大肠杆菌突变株內源过 氧化氢的释放量是有明显的差异的，不论用那一种方法检测，结果都是一致的。 （6）使用酚红法和荧光法时，由于酚红法和荧光法在测定大肠杆菌內源过

34、氧化氢时的灵敏度不同，所以实验结果也不完全相同。 参考文献参考文献 1 张亚彦，林荔，苏必桔碘化钾电蓝分光光度法测定微量过氧化氨j 分析试验室， 2001，20：41-42， 2 樊义峰过氧化氢色度测定方法研究明黎明化工。1992，31：31-33 3 kiassen nv marchington d，mcgowant h c eh20determination by the 13 method and by kmn04titrationanalchem1994，66：2921-2925 4 周增枇，陈健范小芹，李芳流动注射分析光度法测定过氧化氢j 中国纺织大学学 报1990,16：7984

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