马铃薯M病毒重组CP抗血清的制备毕业论文

1、青岛农业大学毕业论文（设计）题 目： 马铃薯m病毒重组cp抗血清的制备 姓 名： 学 院： 生 命 科 学 学 院 专 业： 生 物 技 术 班 级： 2010 级 3 班 学 号： 20103581 指导教师： 郭 宝 太（教授） 完成时间： 2014.6.15 2014年6月15日目录摘要1abstract.2引言31 材料与方法51.1 实验材料51.1.1实验菌株51.1.2主要试剂与仪器51.1.3 培养基51.1.4主要试剂配方51.2方法81.2.1 pvm-cp基因原核表达的诱导与鉴定81.2.2菌体总蛋白的提取和包涵体的溶解81.2.3 pvm重组cp的纯化91.2.4 纯化

2、蛋白的sds-page检测91.2.5蛋白的透析、浓缩与定量91.2.6 pvm重组cp抗血清的制备91.2.7 pvm的elisa测定102 结果与分析102.1目的蛋白的诱导表达与纯化102.2蛋白的透析、浓缩与定量112.3 抗血清效价的测定122.4 pvm的elisa测定133 讨论133.1 马铃薯病毒的检测方法133.2 目的蛋白的纯化与定量143.3 重组cp途径与本研究的创新点143.4 马铃薯病毒抗血清的生产与应用致谢15参考文献15马铃薯m病毒重组cp抗血清的制备生物技术专业 刘 扬 指导教师 郭宝太摘要：用iptg诱导重组菌bl21(pet22b-pvm)中马铃薯m病毒

3、cp基因的原核表达，在总蛋白sds-page图谱上有一条分子量36kda的特异蛋白带，符合预期大小，结果表明pvm-cp基因的原核表达非常成功。用溶菌酶方法首先提取细菌总蛋白，然后利用镍离子亲和层析纯化重组蛋白，获得了高纯度的pvm重组cp。利用高纯度重组cp免疫家兔制备出了抗血清，间接elisa法测定显示抗血清的效价为1：64k。制备的抗血清与pvm阳性物呈阳性反应，也就是说本研究制备的抗血清具有检测pvm的能力。本研究利用重组cp制备出了pvm高滴度的抗血清，为进行pvm的elisa检测奠定了基础，同时也为pvm的elisa试剂盒的组装与应用奠定了基础。关键词：马铃薯m病毒； cp基因；原

4、核表达； 重组cp；抗血清制备 preparation of antiserum against recombinant coat protein of potato virus mstudent majoring in biotechnology liu yang tutor guo baotaiabstract: the recombinant bacterium strain bl21(pet22b-pvm) was induced by iptg, a 36kd specific protein band was found in the sds-page pattern of tot

5、al protein, its size was the same as expected, the result showed that the prokaryotic expression of cp gene of potato virus m (pvm) was successful. total cellular protein of the recombinant bacterium was extracted by lysozyme method and then the pvm recombinant cp was purified with nickel iron affin

6、ity chromatography column. antiserum was prepared by injection of rabbits with the high-purity recombinant cp. indirect elisa detection indicated that the titer of the antiserum was 1:64k. positive reaction was observed between the prepared antiserum and pvm positive sample in id-elisa. the antiseru

7、m prepared in this research has the ability to detect the pvm. in this research, high titer antiserum of pvm was prepared by the use of recombinant cp, it has laid the foundation for the elisa detection of pvm, and also laid the foundation for the assembly and application of elisa detection kit for

8、pvm. key words: potato virus m; coat protein (cp) gene; prokaryotic expression; recombinant cp; preparation of antiserum引言马铃薯(solanum tuberosum l.)是茄科茄属的一年生草本植物，食用部分为块茎。马铃薯是非常重要的粮、菜兼用作物。马铃薯在我国的种植范围较广，但对于单位面积的产量而言，却与马铃薯生产发达的国家有一定的差距。导致这种局面的重要原因之一就是病毒积累引起的种薯退化，这在很大程度上限制了马铃薯产业的发展1。马铃薯满足人们对经济作物的各种要求，同时它

9、可以加工成各种工业产品，使用及其广泛。遗传上马铃薯是同源四倍体的作物，虽然可以有性繁殖，但一般利用块茎进行无性繁殖。常规育种技术用于马铃薯会遇到诸多问题与困难。另外，采用常规的杂交育种方法改良马铃薯品种效率低，过程复杂而且所花费的时间很长。马铃薯病毒能够导致马铃薯品种退化，具体表现是既影响马铃薯的产量，也会造成质量的严重下降2。马铃薯病毒严重制约了马铃薯的产业化，当发生复合侵染时，产量损失更高。马铃薯病毒病的种类繁多，在我国已发现10种以上的病毒，其中常见的马铃薯病毒主要就有六种 3。马铃薯m病毒( potato virus m, pvm )是香石竹潜隐病毒属（carlavirus）成员，它的

10、基因组为正单链rna病毒 4。基因组序列中有6个orfs，另外5端有长度为75个核苷酸非编码区，3端有70个核苷酸的poly(a)5。其中外壳蛋白（cp）是由第三个编码序列中的一个orf编码的，其大小约为34kda5。pvm通过接触传病，分布范围广，可造成大面积减产。目前为止，防治马铃薯病毒，减少其危害的最有效途径是使用无毒种薯。通过茎尖剥离与培养扩繁，可以获得大量无毒（脱毒）试管苗，并可进一步获得脱毒微型薯与种子。病毒脱除难度与效果，因病毒种类不同而异，pvm的脱除就比较困难。对脱毒材料进行严格地检测与筛选，才能获得真正的脱毒材料，进一步保障生产上脱毒种薯的增产效果。植物病毒检测方法可以归纳

11、为三大类：生物实验法，基于核酸的分子检测方法及免疫学（血清学）方法6。马铃薯病毒检测的方法很多，但用于马铃薯种苗病毒检测的方法要求迅速、廉价、无误。基于核酸的分子检测方法是在pcr反应基础上建立起来的检测技术， pcr方法特异性好，灵敏度高。但是该法对仪器和操作人员要求较高，不太合适于现场诊断。生产上适合于对大量样品进行的检测的主要方法是酶联免疫吸附（elisa）法。elisa检测法仍然是国际马铃薯中心认可的马铃薯病毒检测的最基本方法。获得纯化的特异性抗体及酶标记抗体是有效开展elisa检测的关键。检测中可用肉眼或比色法判断测定结果。elisa 用于检测马铃薯病毒始于caspe对马铃薯卷叶病毒

12、(plrv)的检测，认为用elisa 技术进行plrv 的常规鉴定是可行的7。免疫学方法的灵敏度高、特异性强、技术步骤比较简单、能够对大量田间样品进行检测。elisa仍然是当前生产应用最方便、最广泛的检测技术。大量产出高效价的抗血清是免疫学方法应用的关键。在经典的方法中，马铃薯病毒抗血清制备的抗原是提纯病毒粒子。但是用这种方法制备抗血清存在很多弊端。有些病毒在宿主的含量少，难以获得足够的纯化后的抗原。还有一些病毒纯化困难，不易得到纯化的病毒粒子。由于病毒粒子制备的困难，导致国产马铃薯病毒抗血清非常缺乏，明显影响了其应用。利用分子生物学技术可以解决经典方法中遇到的抗原（马铃薯病毒粒子）制备困难问

13、题。具体方法就是利用原核表达的重组cp作抗原制备出马铃薯病毒抗血清。研究表明可以利用重组cp途径（基因工程途径）来制备检测马铃薯病毒抗血清。但目前未见马铃薯重组cp抗血清（抗体）用于大量样品elisa检测的报道，也未见重组cp多克隆抗体用于组装elisa检测试剂盒的报道，相关的研究有待深入。cerovska8等克隆了pvm的cp基因并制备了重组cp的抗血清，且成功用于wsetern分析。国内未见pvm-cp基因原核表达的研究。本研究目的是利用重组cp制备出pvm高效价的抗血清，为实现基于重组cp多克隆抗体的das-elisa检测技术的建立奠定基础，同时也为pvm抗血清及elisa检测试剂盒的国

14、产化与大量生产提供技术保障。本研究的具体的研究内容是：1）诱导重组菌bl21(pet22b-mcp)中pvm-cp基因的表达。 2）提取并溶解包涵体、利用镍离子亲和层析法纯化出重组cp，并进行透析、浓缩与定量。3）利用高纯度重组cp免疫家兔制备出高效价抗血清。 4）抗血清效价测定及pvm的elisa测定。 1 材料与方法 1.1 实验材料1.1.1实验菌株重组菌bl21(pet22b-pvm)由本实验室构建并保存。1.1.2主要试剂与仪器三氯乙酸、sds、glycine、urea、acrylamide、bis-arcylamide、二抗（上海生工）；咪唑（北京鼎国）；去氧胆酸钠（上海伯奥）；蛋

15、白酶抑制剂(pmsf)(sigma)；蛋白质marker；溶菌酶（北京索莱宝）；蛋白纯化柱(hitrap chelating hp)(he heacthcare)。其它试剂均为分析纯试剂。超净工作台（安泰公司）振荡培养箱（上海博迅）电子天平（satorius）ph仪（denver）观片灯（山东兖州通用医疗器械有限公司）恒温循环仪（北京六一）聚丙烯酰胺凝胶制备系统（bio-rad）微型垂直板电泳装置（miniprotean,bio-rad）水平脱色摇床（北京六一）1.1.3 培养基lb固体和液体培养基，调ph至7.4,高压蒸汽灭菌121下15min。氨苄抗性的筛选平板1.1.4主要试剂配方12%

16、分离胶：蒸馏水 5.9ml30% arc-bis 7.2 ml1.5m tris(ph 8.8) 4.3 ml10%sds 180l10% aps 180ltemed 7l5%浓缩胶：蒸馏水 2.75ml30% arc-bis 650l1.5m tris(ph 8.8) 500l10%sds 40l10% aps 40ltemed 4l脱色液配制： 蒸馏水 500ml95%乙醇 400ml 冰醋酸 100mlpbs配制：kh2po4 0.27gna2hpo4 1.42gnacl 8gkcl 0.2g加去离子水800ml，搅拌溶解，加入浓盐酸调ph至9.6，最后定容到1l。高温高压灭菌后室温保存

17、。考马斯亮蓝g250（5）染液配制：考马斯亮蓝g250 20mg95%乙醇 10ml浓磷酸 20ml 定容至40ml，4保存。使用时，用pbs稀释为1考马斯亮蓝g250。结合缓冲液：nah2po4 0.02mnacl 0.5murea 8m咪唑 20mm洗脱缓冲液：nah2po4 0.02mnacl 0.5murea 8m咪唑 0.5m碳酸盐缓冲液（ph 9.6）：na2co3 1.59gnahco3 2.93g加去离子水800ml，搅拌溶解，加入浓盐酸调ph至9.6，最后定容到1l。pbst洗涤缓冲液：pbs缓冲液 100mltween20 50l封闭液：0.25g bsa 加pbst缓冲液

18、至5ml。底物缓冲液（ph 5.0）：柠檬酸 1.02gna2hpo4 3.68g溶于去离子水中，调ph 5.0，定容至100ml。tmb使用液：tmb（1mg/ml溶于dmso） 1ml底物缓冲液 9ml30%h2o2 1l1.2方法1.2.1 pvm-cp基因原核表达的诱导与鉴定 1）用接种环以无菌操作挑取重组菌bl21(pet22b-pvm)菌液一环，划线接种于含有100g/ml amp的lb固体培养液，37培养24h。2）挑取重组菌bl21(pet22b-pvm)的单菌落接种在10ml含有100g/ml amp的lb液体培养液，37震荡培养过夜。3）菌种按1%的接种量接种于200ml含

19、相同浓度amp的lb液体培养基中，37震荡培养2.5-3小时左右，测od600达到0.6-0.9可开始诱导。4）诱导前，接出1ml未诱导的菌液作为对照。5）向剩余培养液中加入1%培养液体积的100mm iptg(终浓度1mm)诱导表达，37震荡培养4h左右。6）接出2ml诱导的菌液分别装入2个1.5ml离心管中作为诱导样。7）sds-page检测诱导效果。1.2.2菌体总蛋白的提取和包涵体的溶解1）将上述步骤中剩余的197ml在4下、4000rpm离心15min。2）弃去离心上清液，对沉淀进行称重，加入裂解缓冲液（每克大肠杆菌加入3ml），将菌体重悬。3)每克大肠杆菌中加入8lpmsf（50m

20、m）和80l溶菌酶（10mg/ml）。4)边搅拌边加入少量去氧胆酸钠。5)等待裂解液变稠，每克大肠杆菌中加入20ldnase(1mg/ml)。6)室温下放置30min左右，至裂解液不再粘稠。7)将裂解液分装在1.5ml离心管中，用微量离心机于4、12000rpm离心2min。8) 沉淀进行包涵体溶解：弃掉上清液，每管沉淀中加入750l结合缓冲液，吹打重悬沉淀，再加入750l结合缓冲液，震荡均匀，约1min后4，12000rpm，离心10min；收集上清液，重复上述步骤，加入750l结合缓冲液吹打重悬，12000rpm，4离心15min，收集上清液。9）用滤膜将上清液过滤。1.2.3 pvm重组

21、cp的纯化 使用5ml镍柱纯化目的蛋白pvm-cp，纯化体系如下：1）用20 ml ddh2o洗柱，避免柱子中存有酒精。2）用2.5 ml的0.1m 硫酸镍洗柱挂镍，活化纯化柱。3）再用20 ml ddh2o洗柱将未挂上的镍洗掉。4）20ml结合缓冲溶液平衡柱子。5）过滤过的样品溶液5-10ml。6）20 ml结合缓冲溶液洗柱将未能结合上柱的蛋白洗掉。7）10 ml洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集中间的5 ml洗脱液。8）40 ml ddh2o洗柱。9）20 ml 20%乙醇洗柱，封柱，4保存柱子。1.2.4 纯化蛋白的sds-page检测 pvm-cp基因诱导表达的效果及重组cp纯化效果都通过s

22、ds-page检测、确认。1.2.5蛋白的透析、浓缩与定量收集蛋白纯化的洗脱液并将其装入透析袋中,封口后，于4，ph7.4pbs 透析，后将透析袋放到peg6000固体中浓缩1-2h，对蛋白进行定量。定量方法如下：1）取6支试管并将其编号，然后分别将0，20，40，60，80，100ml 1mg/ml牛血清白蛋白（bsa）标准溶液（1mg/ml）按梯度对号加入试管中，并加入pbs补足到150ml。2)分别将30ul,60ul待测蛋白质样品加入到另外两支试管中，并用pbs补足至150ml。3）向各个试管中加入2850ul考马斯亮蓝g250染液，充分摇匀。4）595nm下测吸光值。5）利用记录读数

23、绘制标准曲线，并计算样品中的蛋白浓度。1.2.6 pvm重组cp抗血清的制备1.2.6.1 抗血清制备将蛋白样品的浓度调整到1mg/ml，共需要约4-6ml，送上海生工制备抗血清。初免剂量为0.5mg/只，二免、三免、四免剂量为0.25mg/只。共进行四次免疫： 一免：免疫用抗原为弗氏完全佐剂+蛋白抗原； 二免：第三周，免疫用抗原为弗氏不完全佐剂+蛋白抗原。 三免，第7周，免疫用抗原同二免。四免后采血，耳静脉采血1ml，elisa检测抗血清效价。1.2.6.2抗血清的效价测定 制备好的抗血清通过间接elisa测定其效价，样品的稀释和步骤如下：样品稀释：1）抗原：pvm蛋白定量为2mg/ml，设

24、定每孔包被抗原的量为0.2g，每孔抗原包被100l，所以抗原用 pbs以1:1000稀释，浓度为2g/ml。2）抗血清：用pbst按1:1000稀释，后等比稀释。3）二抗：辣根酶标记山羊抗兔igg（h+l）1:8000稀释，用pbst稀释。4）免疫前血清：用pbs按1:1000稀释。 具体步骤：1）包被抗原：将抗原按0.2g每孔包板，阴性对照用免疫前血清100l每孔，空白对照用碳酸盐缓冲液100l每孔包板，37，2h。2）洗板：pbst洗涤3，每次3min。3）封闭：封闭液100l每孔，37，1h。4）洗板：同2）。5）加一抗：100l每孔，37，1h。6）洗板：同2）。7）加二抗：100l每

25、孔，37孵育45min。8) 洗板：pbst洗涤4次，每次3min。 9）测od值：450nm波长。1.2.7 pvm的elisa测定pvm阳性物包被酶标板后，用本研究制备的抗血清进行间接elisa测定，具体方法如1.2.6.2所述。2 结果与分析2.1目的蛋白的诱导表达与纯化重组菌bl21（pet22b-pvm）菌液用1mm iptg在37诱导4小时，在sds-page图谱上有一条大小约为36kda的诱导表达蛋白带，且表达量很大（图1，泳道2）。重组蛋白的预期值为36kda，电泳结果显示重组蛋白的分子量与预期大小一致，也就是pvm-cp基因在受体菌中得到了顺利表达。利用咪唑浓度为30mm的结

26、合缓冲液对重组菌bl21（pet22b-pvm）诱导表达的包涵体蛋白进行纯化。洗脱收集的纯化蛋白进行电泳，获得了36kda的高纯度重组蛋白带（图1，泳道3）m 1 2 3目的蛋白图1 pvm-cp基因的表达和重组蛋白的纯化m：protein marker 1: 菌体总蛋白（没诱导）2: 诱导后的蛋白 3: 纯化出的重组蛋白2.2蛋白的透析、浓缩与定量200ml菌液总蛋白提取后经过结合缓冲液溶解、纯化后得到5ml洗脱液，重组蛋白经透析浓缩，用brandford法进行了定量。测定体系如表1所示，标准曲线如图2所示，并通过od595值计算出纯化蛋白的浓度：30ul待测液（od595为0.517），计

27、算出其浓度为1.36mg/ml；60ul待测液（od595为0.843），计算出其浓度为1.16mg/ml。结果显示200ml菌液可纯化出6mg重组cp。表1 bradford蛋白定量法测定体系试管号01234567标准bsa溶液（ul）020406080100待测蛋白溶液(ul)3060pbs（l)15013011090705012090考马斯亮蓝（ml)2.852.852.852.852.852.852.852.85图2蛋白质定量的标准曲线2.3 抗血清:效价的测定 pvm阳性物购自agdia公司，间接elisa反应中有颜色，呈阳性反应，阴性对照无颜色，该结果表明本研究制备的抗血清具有检测

28、pvm的能力，是pvm特异性抗血清。用间接elisa法测定抗血清的效价，每孔抗原包被0.2g，抗血清1:1000稀释后，倍比稀释。图3是显色20min，450nm波长下测定吸光值。抗血清效价3阴性值，结果表明制备的抗血清的效价为1：64k（表2）。阴性 空白 1k 2k 4k 8k 16k 32k 64k 128k 256k 512k图3 抗血清效价的测定表2 抗血清效价的测定值抗血清浓度阴性空白1k2k4k8k16k32k64k128k256k512k一组0.0820.1150.9830.9740.9670.8250.7060.530.390.2140.1590.169二组0.0950.09

29、71.0221.0260.9580.8840.7230.5280.370.2990.1610.1062.4 pvm的elisa测定pvm间接elisa检测的初步结果见图4。包被的抗原是病毒阳性物，加入抗血清后反应孔显色，且随着抗血清稀释度的增加颜色变浅。包被健康试管苗研磨液作抗原（阴性对照）与不加抗原（空白对照）的反应孔不显色。结果表明本实验制备的重组cp抗血清与pvm呈阳性反应，也就是说该抗血清具有检测pvm的能力，是pvm特异性抗血清。目测结果表明抗血清稀释度为1:8000时，反应孔有可见的颜色，呈阳性。od值测定结果表明抗血清稀释度为1:8000时，反应孔与阴性对照孔od值的比值2，也就

30、是说按比值是2的标准判断，目测结果与od值测定结果基本相符。阴性 空白 500 1k 2k 4k 8k 16k 32k 图4 pvm测定中的显色结果3 讨论3.1 马铃薯病毒的检测方法用于马铃薯病毒检测的方法很多，与其他植物病毒一样，最主要的检测方法仍然是分子生物学方法与血清学（免疫学）方法。基于病毒核酸的分子生物学检测法是检测植物病毒的有效方法9。lamp是检测病毒的新型分子生物学技术，在马铃薯病毒检测中也得到了有效利用。nie10利用一步rt-lamp和两步rt-lamp 技术检测了240 份样品中的马铃薯病毒，检出率均达到97.5%。血清学的一个典型方法就是酶联免疫法，该方法适合于大规模

31、的测试11。在生产上检测马铃薯病的elisa具体方法主要有三种 11。das-elisa于1977年建立，白艳菊等利用该法对马铃薯病毒进行检测时对其做出了改进12。马铃薯病毒特异性抗血清的制备是该法的关键，目前我国利用病毒粒子作抗原自主生产的抗血清数量少，不能满足各种需要，进口抗血清及检测试剂盒价钱高，影响了该技术的普遍应用。3.2 目的蛋白的纯化与定量获得高纯度重组cp是本研究的关键。对重组菌进行诱导表达之后，要先对细菌总蛋白进行sds-page分析，之后再对目的蛋白进行纯化。对原核生物来讲，一般采用ni离子亲和层析法对其重组蛋白进行纯化13。进行金属亲和层析时，离子类型、咪唑浓度以及ph等

32、因素都会影响蛋白与离子的亲和力，其中，咪唑浓度尤其重要。若洗涤液中的咪唑浓度太低，洗脱物中的杂蛋白将不能被完全洗脱，从而使目的蛋白纯度过低，影响后续实验。若咪唑浓度较高，将会洗脱掉部分目的蛋白，导致目的蛋白得率下降。另外，本实验发现，洗脱液中的咪唑浓度也要合适，洗涤与洗脱液合理搭配才能有好的纯化效果。本实验中不仅实现了pvm-cp基因的高效率原核表达，并且采用ni亲和层析法纯化得到了高纯度的目的蛋白，纯化产物完全可以满足抗血清制备的要求。对抗血清制备研究来说，抗原的定量时基本而重要的的要求。一般采用紫外吸收法14和考马斯亮蓝染色法15对重组蛋白进行定量。本实验采用考马斯亮蓝法对重组蛋白质进行定

33、量测定。考马斯亮蓝与蛋白质的结合物5-20min内进行测定，颜色最稳定，实验数据更准确。因此，在实验过程中，一定要动作迅速，快速完成实验。3.3 重组cp途径与本研究的创新点本研究采用了重组cp途径制备马铃薯m病毒的抗血清。与病毒粒子作抗原的传统途径相比，重组cp途径的优点在于：1）制备的重组cp（抗原）纯度高。sds-page图谱上可以达到没有杂带的要求，并且纯度是可以测定的。得到高纯度病毒粒子则非常困难，花费大耗时长。2）可大量快速制备出重组cp。一周之内就可制备出2-3只兔子需要的免疫剂量3）方法稳定可靠。4）安全性高。全过程不涉及病毒粒子，没有造成病毒扩散的隐患。5）制备的抗血清效价高

34、。6）花费低。本研究实现了pvm-cp基因的高效原核表达；优化了pvm重组cp纯化体系。创新点在于利用重组cp制备出了高效价抗血清，且制备的抗血清可以用于马铃薯m病毒的elisa检测。目前，未见重组cp抗血清用于pvm检测的报道。3.4 马铃薯病毒抗血清的生产与应用在我国，马铃薯病毒抗血清的制备工作时断时续，制备出的抗血清都满足不了科研的需要。脱毒种薯生产应用中，主要采用进口抗血清或试剂盒对马铃薯病毒进行检测。应用马铃薯病毒进口检测产品，不仅价格高，限制了应用。在实际检测中会发现必须不能及时获得相关产品也是一种限制。另外，检测实际也有保质期，检测试剂或试剂盒存放时间长了，其质量也会受影响，抗血

35、清的效价会变低。实现主要马铃薯病毒抗血清的国产化才是解决问题的根本之道。本研究利用重组cp成功制备出了高效价的抗血清，为实现基于重组cp多克隆抗体的das-elisa检测技术的建立奠定了基础，同时也为pvm的elisa检测及elisa检测试剂盒的国产化与大量生产提供了技术保障。本研究工作是总体研究的一部分，本实验室的目标是利用重组cp制备出6种主要病毒的特异性抗血清。重组cp途径不仅具有稳定可靠性，同时也具有技术难度低、成本也低的特点，通过该途径制备出足量抗血清是切实可行的。致谢本论文是在导师郭宝太教授的悉心指导下完成的，从课题的选题、方案的设计与实验的具体操作到论文的完成都倾注了导师的心血。

36、导师渊博的知识、严谨的治学态度以及对于科学不断追求的精神让我受益匪浅，并给我很大启迪。在论文试验阶段以及论文写作阶段，导师给我提出了严格的要求，引导我不断开阔思路，鼓励我大胆创新。在论文完成之际，谨向我的导师致以最诚挚的感谢！在实验和论文的完成过程中师姐辛佳、师兄宋志成给予了我专业知识以及实验方面的帮助，师姐师兄的认真负责将成为我日后学习工作的榜样，在此特别感谢！值此论文完成之际，谨向所有帮助、支持过我的老师与同学致以最诚挚的谢意！参考文献：1 jansky s，jin l，xie k，xie c，spooner d. potato production and breeding in chi

37、na. potato research，2009, 52 (1)：5765.2solomon-blackburn r m, barker h. breeding virus resistant potatoes（solanum tuberosum）：a review of traditional and molecular approaches. heredity, 2001, 86 (1)：1735.3 gilbert j, spillane c, kavanagh t a, et al. elicitation of rx-mediated resistance to pvx in potato does not require new rna synthesis and may involve a latent hypersensitive response. mol plant microbe inter