His-Tag蛋白纯化步骤

1、变性条件下从大肠杆菌中纯化多聚组氨酸标签蛋白（主要以包涵体的形式表达）的样品制备1、用 1PBS 重悬细胞沉淀（约每毫升沉淀加 5ml 1 PBS），并按上述方法进行超声破菌。2、12000 rpm 离心 10 min 收集包涵体。若有必要，用1 PBS 洗包涵体几次。3、用 Binding/Wash Buffer （约每毫升沉淀加5ml 1 PBS）溶解包涵体，并在室温下孵育 3060 分钟。若使沉淀充分溶解，有必要进行机械或超声均质。4、12000rpm 离心 30min，取上清至一干净管中。His 标签蛋白的重力纯化流程1ml 柱子的总体积为 10ml，只需加入介质。如果样品体积大于柱子

2、体积，可重复利用，注意不要超过树脂的结合能力。1、平衡柱子的工作温度。应在室温或4下进行纯化。2、取出底帽，倒出多余的液体，直立固定好柱子，让柱子顶部朝上。3、用 2 倍树脂体积的 Binding/Wash Buffer 平衡柱子， 以 0.51 ml/min 的流速过柱。4、从柱子上部加入经 Binding/Wash Buffer 处理的大肠杆菌裂解物或蛋白提取物，收集流出液。若需要，让流出液重新过柱一次，以最大限度地提高结合力。5、用两倍树脂体积的 Binding/Wash Buffer 洗涤树脂并收集流出液。 重复该步骤，用一新的收集管收集流出液。直到流出液的吸光度在 280 nm 基线

3、处。6、用两倍树脂体积的 Elution Buffer 将 His 标签蛋白从树脂上洗脱下来。重复此步骤两次，并单独收集每次洗脱出来的液体。7、用 Modified Coomassie Bradford Assay Kit （No SK3041）。洗脱的蛋白可直接进行 SDS-PAGE 分析。注意：洗脱获得的蛋白可用凝胶过滤（如No BSP090 gravity Desalting Column）或透析去除咪唑以便后续应用。 SDS-PAGE 分析前，含 6M 盐酸胍的样品必须用含 8 M 尿素的缓冲液透析。就地清洗方案如果背压增加或观察到树脂明显污染，通常进行完全性能恢复流程。 由于所有的N

4、I-IDA 树脂的高螯合强度和低金属浸出率，就地清洗前不需要进行 stripping。我们建议使用下面的方法， 以清除污染物， 如沉淀的蛋白、 疏水结合蛋白和脂蛋白。程序1、用 15 倍树脂体积的 0.5 M NaOH 清洗柱子。考虑到需要 30min 的接触时间，因此需相应地调整流量（如用 0.5 M NaOH 溶液以 0.5ml/min 的流速洗 1ml 的 NI-IDA 柱，需要相当于 15ml 总体积的量）。2、用 10 倍树脂体积的 1 PBS 重新平衡后，树脂可马上使用。若要保存柱子，可加入 2030%乙醇或 10100mM 氢氧化钠进行 4保存。通过洗脱（ stripping）和

5、离子重填装进行再生1 / 3NI-IDA 柱的洗脱（ stripping）和再填装通常是没有必要的。如果背压增加或观察到树脂明显污染， 就地清洗过程通常可恢复性能。 但若性能仍不令人满意， 柱子内的 NI-IDA 树脂可用下面的程序进行洗脱（ stripping）和离子重填装。程序1、用 10 倍树脂体积的洗脱缓冲液（ Stripping Buffer ）（ 50 mM 磷酸钠； 300 mM NaCl；100 mM EDTA ，pH 值 8.0）洗涤树脂。2、用 20 倍树脂体积的去离子水清洗树脂。3、用 2 倍树脂体积的 100mM NiSO 4（用去离子水配制）进行离子再填装。4、10

6、倍树脂体积的去离子水清洗， 并用 10 倍树脂体积的 1 PBS 重新平衡树脂，树脂可马上使用。若要保存柱子，可加入 20 30%乙醇或 10100mM 氢氧化钠进行 4保存。问题解答问题可能的原因样品太黏流速太慢纯化过程中目的蛋白难溶或沉淀His-Tag 蛋 白 没有完全被洗脱样品制备和洗涤过程中发现流出液中存在His-Tag 蛋白His-Tag 蛋白产量低纯化过程中His-Tag 蛋 白 没有被洗脱下来洗 脱 的样品和缓冲液His-Tag 蛋中咪唑的浓度建议如果纯化是在 4进行，那改为在室温下进行。超声破菌前或超声破菌后增加细胞裂解物的稀释度。继续超声破菌，直到黏度下降；和/或额外加入 D

7、NAse 和Mg2+。如果用很黏稠的溶液，将柱子连接到真空管以增加流速添加去垢剂或其他物质， 缓慢混合 30min 以增加目的蛋白的可溶性。 注意： Triton X-100 和NP-40（不是 Tween）在280nm具有高吸光度，此外，去垢剂不能通过缓冲液置换而轻易去除。包涵体： 用常规变性剂如 46 M 盐酸胍、 48 M 尿素或强变性剂，蛋白很容易从包涵体中溶解（和去折叠）。缓慢混合 30min或更长时间以助溶目的蛋白。额外增加几毫升的elution buffer 进行洗脱样品和结合缓冲液中咪唑浓度太高，使用低浓度的咪唑。确定样品中螯合剂或强还原剂的浓度不要太高。组氨酸标签可能暴露不充

8、分；对包涵体，可用尿素或盐酸胍对去折叠的蛋白进行纯化。减少样品的稀释，增加固体尿素或盐酸胍。组氨酸标签丢失。检查结构的序列。 His-Tag 蛋白仍然被结合。洗脱液中用高浓度的的咪唑进行洗脱目的蛋白沉淀在柱子中，减少样品的量；洗脱过程中降低咪唑的量。尝试去垢剂或改变 NaCl 的浓度或在变性（去折叠）条件下洗脱。非特异性疏水或其它互作。在洗脱缓冲液中加入非离子去垢剂或增加NaCl 的浓度。样品和缓冲液中使用高浓度的咪唑以阻止杂蛋白结合。推荐使用 2040mM ，但更高浓度可能也适合。2 / 3白不纯太低未结合物质洗样品制备后重复洗涤步骤以获得最佳纯度涤不充分His-Tag 蛋 白 被增加蛋白酶抑制剂（避免含 EDTA ）。在 4进行进行裂解和蛋白酶部分降纯化。解His-Tag 蛋 白 有超声破菌前，洗涤缓冲液中增加去垢剂的