人类基因组学(1)

1、.1 n 第三章 人类基因组学 human genomics n概述: n 第一节 人类基因组 n基因组(genome):一个生命体遗传信息的总和(单 倍体细胞内) n人类基因组(括:核基因组和mt基因组。通常指) n2万 24种DNA 25种DNA n相同：99.99% 不同： 0.01% .2 n第二节 基因组学 n基因组学(genomics):在整个基因组的层次上总体 研究某一物种的所有基因的结构与功能,以及所有 物种细胞的基因组在结构、功能上的异同关系。 n 结构基因组学：数量 位置距离序列 基因组学 功能基因组学：表达 调控 功能 n 比较基因组学：比较不同物种基因组的异 n一、 人

2、类基因组计划 n（ human genome project，HGP) 三大计划 n 计划的提出及任务 n1986 Renato Dulbecco .3 1990.10 美国启动该计划 30亿美元 15年 n最初目标：1）构建人类基因组遗传图和物理 图。2）确定人DNA全部核苷酸序列。3）定位 全部基因。4）对其他生物进行类似研究。 n93年，增人类基因组的鉴定和分离。 n98年，增基因组多样性、强化功能基因组的研 究。 参与研究者 n美、英、日、法、德、中、私人企业、研究公 司、制药集团。 .4 n HGP的意义 n理论意义：测序 基因数 基因功能 n医学意义：提供一个可资借鉴的正常人类基因

3、 信息库 先知先觉 n产前基因诊断. n治疗 n药学意义 “对因下药” n附:我国水稻基因组研究 n2002,4,4, 中科院 Science 绘制完 成水稻基因组序列 n总数：46022-55615 n打破“生命越高级，基因数越多”的误区。 .5 n 基因组作图和DNA测序 n概述 HGP任务：构建遗传图、物理图、确定DNA序 列、定位基因 n基因组作图（genome mapping）：将基因组这一巨大 研究对象分解成较易操作的小的结构区域，分析研究。 （一）遗传图（genetic map）或连锁图（lingkage map） n 将每条染色体上的基因或遗传标记的相对位置经连 锁分析确定下来

4、构成的图。 n 经计算连锁的遗传标志间的重组率，确定基因的 相对距离，用厘摩表示（centrimorgan，cM）， 1厘 摩（cM）=减数分裂时两个基因间重组率为1%。 n例：A和B间的重组率为2 n连锁图 A B C 2 3 5 .6 n绘制遗传图需用多态性(遗传)标志 n第一代遗传标志（1975） n限制性酶切片断长度多态性(restriction fregment length polymorphism,RFLP) n此类标志较少,多态信息低，应用受限。 n例： 2000Kp A基因 第二代遗传标志（1989） ： 短串联重复序列（short tandem repeat，STR）， 又

5、称微卫星（microsatelite，MS）标志，主要为二 核苷酸重复序列，如（CA）n 信息量大，优于第一代。 .7 n第三代遗传标志：即单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP） （1996） nSNP定义：基因组中某一碱基的变异，频率大 于1%。 n数量多（300多万），覆盖密度高。 n作用：用于遗传作图；多样性研究；识别、定 位疾病相关基因。 .8 n（二）物理图（physical map） n 即确定各遗传标志之间的物理距离的图谱，以碱基 对数量表示（bp，kb，mb（兆碱基）。 n物理图含两方面含义： n其一：指以一段已知核苷酸序列的DN

6、A片段（即称为序列标签部 位，sequence tagged site,STS）为“位标”，以Mb或Kb作为图 距的g图.例： n对STS的要求： n（1）在g组中有明确的位置 n（2）一段已知的序列，可用PCR扩增的单拷贝序列。 位标A 位标B 位标C 3kb 2Mb .9 n其二：在以上基础上构建覆盖每条CS的大片 段DNA邻接克隆系（contig） ACGTCGTGC ACGTCGTGC GTCGTGC STS5 STS4STS2STS3 STS1 STS2STS5STS6 STS3 STS4 STS1STS2STS3STS4STS5 STS6 STS2STS3 STS5 STS4 图图

7、 STSSTS与与conting conting 构建图解构建图解 不同DNA片段的克隆 ContigContig的构成的构成 .10 n 构建物理图时，先用限制酶将染色体DNA切成一个 个片段，将之插入载体进行克隆化。 n这些载体包括： n（1）酵母人工CS（yeast artificial chromosome,YAC） 插入片段长度：0.52个Mb大片段. n（2）细菌人工CS（bacterial artificial chromosome,BAC）插入片段:80300kb n（3）P1噬菌体（bacteriophage P1）插入片段,最大125kb. n（4） P1来源的人工CS（P

8、1-deriverd,PAC）插入片段,300kb n多用BAC构建克隆，然后对BAC克隆逐一测序。 n将随机长度的将随机长度的DNA片断在染色体上的排列顺序确定下来。片断在染色体上的排列顺序确定下来。 这些克隆这些克隆DNA片断连接起来，形成重叠克隆群片断连接起来，形成重叠克隆群 （Conting），再将一个个（），再将一个个（Conting)相连成线状，覆相连成线状，覆 盖整个染色体。盖整个染色体。 .11 n（三）序列图（sequence map) n 经对基因组进行序列分析所建的图。亦指对g组的大 规模测序。32亿bp。 n1、 g组DNA大规模测序（DNA测序的策略） n（1）基于B

9、AC连续克隆系的测序 n概括：在构建好BAC连续克隆系后（确定每一BAC所对 应CS的区域）,对BAC逐一测序. n步骤： n1) 将待测BAC克隆随机切成小片段（约1.52kb） n2) 将小片段克隆入测序载体 n3)对小片段DNA进行810倍左右覆盖率的测序 n4) 将相互重叠的读出序列（reads）组装成连续的重叠线。 n5) 从质量最高的读出序列中取得序列。 n6) 利用引物延伸或其他方法对BAC克隆中还存在的缝隙（gap）进 行填补(gap filling) .12 n（2）全g组的“鸟枪法”测序 n此策略不需要先构建YAC、BAC重叠群 直接将g组DNA分 解成2kb左右的小片段进

10、行随机测序，再用计算机进行 策略组装。 例Celera公司 n测序自动化 n2、cDNA测序 n对人类g组中能转录表达的序列（即g）进行测定。2% n【概括序列图过程（两种技术路线两种技术路线）（参考）： （1 1）公共序列路线：公共序列路线：即在物理图基础上，将各个即在物理图基础上，将各个BACBAC克隆片段切成克隆片段切成 更短的片段，形成亚克隆分别进行测序，再将相互重叠的读出序列组装更短的片段，形成亚克隆分别进行测序，再将相互重叠的读出序列组装 成连续重叠线。成连续重叠线。 （2 2）“鸟枪法鸟枪法”测序路线：测序路线：即直接将基因组即直接将基因组DNADNA分割成分割成2kb2kb左右

11、的左右的 小片段进行随机测序，再用超级计算机组装成重叠线。所形成的序列图小片段进行随机测序，再用超级计算机组装成重叠线。所形成的序列图 称称celeracelera序列。序列。 ACGTCCGA ACGTCCGATCGGTTCATGCCTCGGTTCATGCC TCGGTTCATGCCTCGGTTCATGCCAATGCCGTCCAATGCCGTCC】 .13 n3、DNA序列的生物信息学分析 n生物信息学：利用计算机对DNA和Pr序列资料中各种 类型信息进行识别、储存、分析、模拟和传输的科学。 n4、g组测序的成就 n（1）模式生物体g组测序 n表 g组测序现状 生物体预测g数完成状况 大肠杆

12、菌4288100% 面包酵母5855100% 线虫18424100% 果蝇13601近100% 小鼠410万6.1% 人类(01.2.15)2 2.5万99% .14 n（2）人类g组测序 n1、2001-2-12，6国完成人类g组工作框架图。 n2、2000-4-6，Celera，完成某男g组序列。 n3、1999-12，英、日、美、加、瑞科学家完成 22号CS测序（33.4Mb），545g、134假g。 n4、2000-4，日、美、德完成21号CS测序。 n5、2004.10，公布人类基因组计划完成图。 n2006.5.18，英美完成1号CS测序，2.23亿bp， 3141个基因，基因突变

13、与350中疾病有关。 .15 n（四）基因图（gene map) n据序列图，用不同方法预测出基因所在位置的图。 n方法： n（一）CpG岛的应用 CpG岛指每个基因5 端转录起点处富含CpG的一段DNA。 n故，测序中，每发现一CpG岛，即意味此处有一基因。 n（二）计算机的应用 n用计算机预演系统GRAIL可从未知DNA中确认外显子。 n（三）cDNA策略 n 分离出mRNA，反转录成cDNA片段，此为表达序列标签 （expressed sequence tag,EST),定位后构成的图称转录图 (transcriptinal map,又称表达图expression map)（基因图雏形）

14、 n据此可估计基因组中基因数。 n人基因组中基因数：2-2.5万。 n不同个体间基因编码差异：0.01% .16 （past-genome project，PGP） 后基因组计划：在基因组层次上研究所有基因的表后基因组计划：在基因组层次上研究所有基因的表 达、调控与功能，即功能基因组学达、调控与功能，即功能基因组学（functional functional genomicsgenomics）。 PGP的研究领域的研究领域 人类基因组多样性计划人类基因组多样性计划 环境基因组学环境基因组学 蛋白质组学蛋白质组学 疾病基因组学疾病基因组学 比较基因组学比较基因组学 药物基因组学药物基因组学 生物

15、信息学生物信息学 二、后基因组计划二、后基因组计划 .17 （一）、人类基因组多样性计划人类基因组多样性计划 （human genome diversity projecthuman genome diversity project，HGDPHGDP） 人类基因数量约人类基因数量约2-2.52-2.5万个万个 人类基因组人类基因组DNADNA含含3 310109 9bpbp 不同个体基因编码仅有不同个体基因编码仅有0.01%0.01% 差异差异 20102010年完成国际千人年完成国际千人g g组计划组计划 种族多样性种族多样性 族群多样性族群多样性 个体特异性个体特异性 人类基因组的多样性与

16、同一性人类基因组的多样性与同一性 .18 （二）比较基因组学（二）比较基因组学（comparative genomics） 各种模式生物基因组序列的比较各种模式生物基因组序列的比较 生物种类生物种类 基因组大小基因组大小 预测基因组数目预测基因组数目 基因平均长度基因平均长度 大肠杆菌大肠杆菌4.6Mb 4.6Mb 1800 1800 约约1 1kbkb 酵母酵母 12Mb 12Mb 5800 5800 约约2 2kbkb 秀丽线虫秀丽线虫 97Mb97Mb18500 18500 约约5.35.3kbkb 果蝇果蝇 116Mb 116Mb 13600 13600 约约1010kbkb 小鼠小鼠

17、 3000Mb3000Mb4000040000约约3030kbkb 人人 3164Mb 3164Mb 2-2.52-2.5万万2727kbkb .19 生物基因组进化的连续性分析生物基因组进化的连续性分析 21%21%的基因原核生物和真核生物共有的基因原核生物和真核生物共有 32%32%的基因真核生物共有而原核生物没有的基因真核生物共有而原核生物没有 24%24%的基因动物所共有的基因动物所共有 22%22%的基因脊椎动物特有的基因脊椎动物特有 .20 （三）（三）蛋白质组学蛋白质组学(proteomics) 蛋白质组蛋白质组(proteome)：细胞的基因组所表达的执行生 命活动的全部蛋白质

18、就构成蛋白质组。 蛋白质组学蛋白质组学(proteomics) ：研究基因组表达的全部蛋研究基因组表达的全部蛋 白质及其相互作用的科学。白质及其相互作用的科学。 .21 （四）环境基因组学（四）环境基因组学（enviromental genomics） 是研究与环境因素相关的疾病易感性基因的。是研究与环境因素相关的疾病易感性基因的。 环境相关的疾病易感基因环境相关的疾病易感基因 基因多态性基因多态性 分类分类 环境成份环境成份 相关疾病相关疾病 CYPCYP1 1A A1 1 激活激活吸烟吸烟 肺癌肺癌 GST GST 解毒解毒 吸烟吸烟 肺癌肺癌 NATNAT2 2 解毒解毒吸烟吸烟 膀胱癌

19、、乳腺癌膀胱癌、乳腺癌 TCFTCF2 2转录因子转录因子母亲吸烟母亲吸烟 唇裂、腭裂唇裂、腭裂 ALAD ALAD 生物合成生物合成 铅铅 铅中毒铅中毒 .22 （五）疾病基因组学（五）疾病基因组学（morbid genomics） 主要任务是分离重要疾病的致病基因与主要任务是分离重要疾病的致病基因与 相关基因，并确定其致病机制。相关基因，并确定其致病机制。 1.1.肿瘤癌基因和抑癌基因的定位与克隆；肿瘤癌基因和抑癌基因的定位与克隆； 2.2.单基因病致病基因的定位与克隆；单基因病致病基因的定位与克隆； 3.3.多基因病数量性状基因座（多基因病数量性状基因座（QTLQTL）的定位）的定位 与

20、克隆。与克隆。 .23 （六）药物基因组学（六）药物基因组学（pharmacogenomics） 是研究药物及化学物质引起机体反是研究药物及化学物质引起机体反 应上的遗传差异，即药物多态性的学科，应上的遗传差异，即药物多态性的学科， 以便能更安全有效的使用药物，和发现新以便能更安全有效的使用药物，和发现新 的药物。的药物。 “对因下药对因下药”-个体化医学个体化医学 .24 （七）生物信息学（七）生物信息学（bioinformaticsbioinformatics） 是生物学与计算机科学和应用数是生物学与计算机科学和应用数 学交叉的一门新兴学科，对生物学实学交叉的一门新兴学科，对生物学实 验数

21、据的获取、加工、存储、检索与验数据的获取、加工、存储、检索与 分析，进而达到揭示数据所含的生物分析，进而达到揭示数据所含的生物 学意义有重要作用。学意义有重要作用。 .25 国际上三大公共基因数据库：国际上三大公共基因数据库： Gene BankGene Bank：美国国家生物技术信息中心（：美国国家生物技术信息中心（ NCBINCBI） (National Center for Biotechnology Information) EMBLEMBL：美国欧洲生物学信息研究所（：美国欧洲生物学信息研究所（EBIEBI） （The European Molecular Biology Labor

22、atory） DDBJDDBJ：日本信息生物学中心（：日本信息生物学中心（CIBCIB） (DNA Data Bank of Japan) 生物信息学已改变了基础生命科学研究的运作方生物信息学已改变了基础生命科学研究的运作方 式，极大地提高了工作效率。式，极大地提高了工作效率。 .26 第三节第三节 基因的遗传分析方法和技术基因的遗传分析方法和技术 包括基因定位（包括基因定位（gene mappinggene mapping）、基因）、基因 克隆（克隆（gene cloninggene cloning）和全基因组扫描）和全基因组扫描 .27 一、基因定位一、基因定位（gene mappingg

23、ene mapping） 就是用一定方法，将各个基因确定到就是用一定方法，将各个基因确定到 染色体的实际位置。染色体的实际位置。 n工作历史工作历史 n主要方法主要方法 连锁分析（连锁分析（linkage analysislinkage analysis） 体细胞杂交（体细胞杂交（somatic cell hybridizationsomatic cell hybridization） 原位杂交（原位杂交（hybridization in situhybridization in situ） 放射杂种（放射杂种（radiation hybridradiation hybrid） 计算机识别（计

24、算机识别（computer identifycomputer identify） .28 1 1连锁分析连锁分析 同一条染色体上的不同基因呈线性同一条染色体上的不同基因呈线性 连锁关系，在减数分裂后，结合家系分连锁关系，在减数分裂后，结合家系分 析，可鉴定子代中的重组体，通过重组析，可鉴定子代中的重组体，通过重组 值计算，可推断待定位基因与已定位基值计算，可推断待定位基因与已定位基 因间的连锁关系和遗传距离，而实现基因间的连锁关系和遗传距离，而实现基 因定位。因定位。 .29 两个基因如非连锁，则重组值两个基因如非连锁，则重组值=50%=50%，即随机，即随机 组合。组合。 减数分裂减数分裂产

25、生配子产生配子 发生交换发生交换 A b a B A b a B A B A B a b a b a b a B A B A b 两个基因如连锁，则重组值两个基因如连锁，则重组值50%50%，且重组，且重组 值与遗传距离成正比。值与遗传距离成正比。 .30 2.2.体细胞杂交体细胞杂交 人人/ /鼠融合细胞的特点：鼠融合细胞的特点： 融合细胞兼有有双亲细胞染色体，但融合细胞兼有有双亲细胞染色体，但 鼠一方染色体一般全部保留，而人一方染鼠一方染色体一般全部保留，而人一方染 色体在细胞增殖过程中优先丢失，以至最色体在细胞增殖过程中优先丢失，以至最 后仅剩少数几条，乃至后仅剩少数几条，乃至1 1条人

26、染色体是基因条人染色体是基因 定位的好材料。结合染色体显带和生化分定位的好材料。结合染色体显带和生化分 析技术，可把某些生化性状决定基因定位析技术，可把某些生化性状决定基因定位 在保留的一条染色体上。在保留的一条染色体上。 .31 杂种细胞克隆嵌板杂种细胞克隆嵌板 杂种克隆杂种克隆 保留的人类染色体保留的人类染色体 1 12 23 34 45 56 67 78 8 A A+ + + + + B B+ + + + + + C C+ + + + + + + + .32 3.3.原位杂交原位杂交 是核酸分子杂交技术在基因定位中的应是核酸分子杂交技术在基因定位中的应 用。用经放射性同位素标记的探针，同

27、染色用。用经放射性同位素标记的探针，同染色 体标本载玻片上原位变性的染色体体标本载玻片上原位变性的染色体DNADNA进行进行 分子杂交，通过放射自显影来检测与探针杂分子杂交，通过放射自显影来检测与探针杂 交结合的染色体同源序列，依据放射性探针交结合的染色体同源序列，依据放射性探针 在染色体上的显影位置进行基因定位。在染色体上的显影位置进行基因定位。 荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISHFISH） .33 4.4.放射杂种放射杂种 是用射线辐射人体细胞染色体，使其随是用射线辐射人体细胞染色体，使其随 机片段化，再与鼠细胞融合，形成人机片段化，再与鼠细胞融合，形成人/ /鼠细鼠细 胞放射杂种，人的

28、随机染色体片段，整合胞放射杂种，人的随机染色体片段，整合 入鼠细胞染色体中。构建放射杂种细胞系入鼠细胞染色体中。构建放射杂种细胞系 克隆嵌板，可用于基因定位。克隆嵌板，可用于基因定位。 .34 二、基因克隆二、基因克隆（gene cloninggene cloning） 是从基因组中把某一基因用一定方法分是从基因组中把某一基因用一定方法分 离出来，以便进行单一基因精细结构和功能的离出来，以便进行单一基因精细结构和功能的 研究。研究。 基因克隆的三种策略：基因克隆的三种策略： 功能克隆（功能克隆（functional cloninsfunctional clonins） 定位克隆（定位克隆（po

29、sitional cloninspositional clonins） 候选克隆（候选克隆（cardidate cloninscardidate clonins） .35 1.1.功能克隆功能克隆 根据目的遗传性状的特征，分析决定基因根据目的遗传性状的特征，分析决定基因 的功能，推测有关蛋白质。的功能，推测有关蛋白质。 分析纯化这一蛋白质，并测出部分氨基酸分析纯化这一蛋白质，并测出部分氨基酸 顺序。顺序。 根据遗传密码推测可能的根据遗传密码推测可能的mRNAmRNA序列。序列。 设计相应的寡核苷酸探针，杂交筛选设计相应的寡核苷酸探针，杂交筛选cDNAcDNA 或基因组或基因组DNADNA文库，

30、最终获得决定基因的文库，最终获得决定基因的 基因克隆。基因克隆。 .36 2.2.定位克隆定位克隆 收集目的遗传病的家系，选择遗传标记进收集目的遗传病的家系，选择遗传标记进 行连锁分析，建立目的遗传病与基因组中行连锁分析，建立目的遗传病与基因组中 某染色体区域中遗传标记的连锁关系。某染色体区域中遗传标记的连锁关系。 根据这一位置信息，将遗传图中初步确定根据这一位置信息，将遗传图中初步确定 的位置，转变成物理图中相应区域的的位置，转变成物理图中相应区域的DNADNA“ 邻接克隆群邻接克隆群”。 .37 从相应区域的从相应区域的“邻接克隆群邻接克隆群”中筛选可中筛选可 表达的结构基因，作为候选基因

31、；表达的结构基因，作为候选基因； 在若干个候选基因中进行转录表达和突在若干个候选基因中进行转录表达和突 变鉴定分析，最终将目的遗传病的决定基变鉴定分析，最终将目的遗传病的决定基 因精确定位和分离克隆该基因。因精确定位和分离克隆该基因。 .38 定位克隆定位克隆策略示意策略示意 DNADNA测序测序 遗传家系遗传家系 遗传图谱遗传图谱 连锁定位分析连锁定位分析 物理图谱物理图谱 候选克隆候选克隆 表达图谱表达图谱 候选基因候选基因 突变检测突变检测 .39 功能克隆与定位克隆的比较功能克隆与定位克隆的比较 .40 3.3.候选克隆候选克隆 候选克隆策略是在已定位和已克隆的候选克隆策略是在已定位和已克隆的 基因越来越多的背景下，形成的一种新的基因越来越多的背景下，形成的一种新的 基因克隆途径。基因克隆途径。 分为：分为： 定位候选克隆定位候选克隆 功能候选克隆功能候选