石蜡切片技术专业知识讲座

1、文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 二、石蜡切片技术的优点二、石蜡切片技术的优点 为什么选择这一技术呢？主要因为它有 以下优点：便于推广、经济、适用、简 便。 ?经济,价格低，可反复使用； ?技术难度不大，容易掌握，但要精通也不 容易； ?设备要求不高 ； ?可长期保存； ?染色容易，而且都能被染色，形成好的反 差和好的选择性。 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 三、石蜡切片的主要过程三、石蜡切片的主要过程 杀生（取材）固定冲洗脱

2、水 保存透明石蜡透入包埋 切片复水染色脱水封藏 观察保存 ?（一）取材、固定、洗涤、脱水 ?（二）透明、透蜡、包埋 ?（三）切片、贴片 ?（四）染色、封藏 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 （一）取材（一）取材 杀生（动物） ?1.目的：动物必须杀生，然后取出所需组织 ?2.方法：一般采用乙醚（氯仿）麻醉后解剖， 取出所需组织。 ?3.注意事项： ?性别合适 ?麻醉前动物生活正常，以免影响其代谢活动， 进而影响细胞结构 ?取材部位要准， ?速度快 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，

3、请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 （一）取材（一）取材 1.目的：得到所需要的组织 2.方法：a.用剪刀剪下组织 b.冲洗动物组织，动物（生理盐水、糜蛋白酶溶 液）植物（缓冲液或水）冲洗干净，防止失水，避免压挤 损伤，用生理盐水、糜蛋白酶冲去表面的血、粘液和赃物。 c.切成小块 3注意事项： ?要准 ?要快 ?避免损伤（方向，刀要快，不能挤压） ?植物取材：用剪刀剪下材料时一定要植物生活正常，不要 因缺水、营养和温度光照发生明显改变，影响细胞结构， 同时发育程度、部位要准。 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系

4、本人或网站删除。 （二）固定（二）固定 1.目的： 为了使取样的细胞在形态结构和成分方面 保持与生活的状态一样，就必须迅速杀死细胞 避免失水变形，自溶破坏结构等。 固定液的选择：快；不溶解；不收缩膨胀； 软硬适中；增加折光度；增加染色能力；长期 保存等7项。 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 2.2.方法方法 ?（1 1）固定剂的种类：一般采用化学固定 单纯固定：只用一种试剂固定： 混合固定：用两种或两种以上的试剂混 合在一起进行固定如： 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模

5、仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 单纯固定：单纯固定： ?福尔马林formalin:10%的甲醛（37%40%） ?醋酸（0.3%5%） ?苦味酸（饱和溶液，三硝基苯酚） ?铬酸0.51% ?锇酸12% ?升汞（氯化汞饱和水溶液约7%） 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 混合固定： ?用两种或两种以上的试剂混合在一起进行固定如： ?卡诺氏固定液 酒精：冰醋酸（3：1） 酒精：冰醋酸：氯仿（6：1：3）适用于动植物一 般组织细胞。 ?FAA 福尔马林(38%甲醛)5 ml: 冰醋酸5ml:70%酒精9

6、0 ml 幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精,可防止材料收缩;还 可加入5 ml甘油(丙三醇)以防蒸发和材料变硬. ?但单细胞及丝状藻类除外，也不适于细胞学研究 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 ?卡诺氏固定液(Carnoys Fluid) 适用于一般植物 组织和细胞的固定 ,常用于根尖,花药压片及子房 石蜡切片等.有极快的渗透力,根尖材料固定15 20min即可,花药则需1h左右,此液固定最多不超过 24h,固定后用95%酒精冲洗至不含冰醋酸为止 ;如 果材料不马上用,需转入70%酒精中保存.固定液的 重要特

7、性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染 色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱 性，达到优良染色效果。 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 ?F.A.AF.A.A固定液 又称标准固定液,万能固定液.适 用于一般根,茎,叶,花药,子房组织切片.在植 物形态解剖研究上应用极广; ?FAAFAA固定液的优点在于：兼有保存剂作用,冰醋 酸既能抵消酒精和甲醛对组织的收缩作用又是 细胞核的优良固定剂，沉淀核蛋白，且对免疫 组化无碍更无掉片之理。FAA固定液具有强大 的固定效能，较之单纯固定更科学更快更好！ 对染色体的观察效

8、果较差. . 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 （2）固定方法 ?静置固定：将组织块放入盛有固定液的小的 称量瓶、小烧杯或青霉素瓶中，在室温或低 温（04）固定一段时间，不断摇动能增 加固定效果，植物和动物经常使用这种方法。 ?灌注固定：常用于动物，将固定液通过已麻 醉的动物血管中，让血液流动，固定所需细 胞，该方法有点，固定均匀，不出现自溶现 象，但较繁琐。 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 3.固定时应注意的事项 固定条件的

9、选择： 种类、浓度、温度和时间 固定要快否则会自溶： 组织快，不能太多，否则固定不透： 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 （三）冲洗（三）冲洗 1.冲洗的目的 除去固定剂，主要是防止固定的毒害作用， 固定时间太长，组织收缩变脆。 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 2.冲洗的方法冲洗的方法 冲洗液随固定液而定，冲洗的选择：不形 变提取，不反应，有效除去固定液。 ?固定液为水溶液时，以水或低浓度的酒精冲 洗； ? 固定液是酒精多以不

10、同浓度的酒精冲洗， 以酒精冲洗，浓度要低于固定液的酒精浓度。 材料与酒精的比例一般为1：10（加入的体积） （70%乙醇换洗3次，每次2060min ） 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 （2）冲洗方法）冲洗方法 ?静置冲洗：静置冲洗：加入冲洗液，静置一段时间，倒出 该液，加入新的冲洗液，反复几次（56次）， 每次30分钟左右，振荡有好处。（时间开始一 次为2030分钟，以后几次可延长12h，）具 体时间与材料性质、大小和温度有关。 ?流水冲洗：流水冲洗：将小瓶用纱布蒙住，放入盆中，流 水冲洗，效果较静置冲洗为

11、好，时间为1224h， 但流水不能太大太急，也不能太长，太长使组 织变软肿胀，冲洗时间有时长达24h左右，如 木本植物的木质部。 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 3.3.注意事项注意事项 (1) 冲洗彻底否则收缩、变硬、抽取 (2)不能时间太长太急变软，肿胀（吸水） (3) 摇动有利于冲洗干净加快分子运动 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 （四）脱水（四）脱水 1. 目的： 因石蜡与水不混合，在用石蜡透入前必须将细 胞中的水彻

12、底脱掉，否则石蜡进不去材料，无 法让细胞变硬，无法进行切片。 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 2.2.方法方法 ?脱水剂的选择 原则：凡与水和石蜡亲和性好的且不使细胞剧 烈收缩膨胀，不能大量抽提细胞成分均可作为脱水剂。 常用的是乙醇和丙酮，使用乙醇最多，此外还有叔丁醇、 正丁醇等。 ?脱水的一般过程：多采用静止脱水15%35% 50%70%83%95%100%（23次），丙酮 较酒精快，浓度相应低一些。起始浓度的选择主要根 据材料的性质而定，动物和幼嫩植物一半从15%或35% 开始；老的或木质成分多从15%或

13、70%开始。如木本 植物的茎。 ?脱水时间：每次脱水时间也是根据细胞的老嫩即含水 量和组织块大小及温度而定，原则是嫩短老长，嫩的 15-30m，老的30m-4h，还可长达8-12h，如洋葱一般 为1h ?脱水的温度：室温和0-4C两种，前者时间短，后者 缓慢一些。 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 3.注意事项：注意事项： ?脱水一定要脱干净，彻底， 否则石蜡很难进入而 导致不能切片。 ?脱水时间长短要合适， 太短脱不干净，太长低浓 度容易细胞变软，膨胀；太长高浓度则细胞收缩， 变脆，提取严重，影响切片。 ?梯

14、度不能太大，负责拉伤，最后100%乙醇脱水要 2-3次，以保证脱水完全。 ?保存，只能在70%酒精中保存（04） 若时间不 够可暂时保存在70%酒精中过夜，第二天再继续 实验。也可长期保存几个月，在 1：1：1=甘油： 蒸馏水：95%酒精中保存最好（低温） 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 （五）透明（五）透明 ?1.目的： 为了使石蜡更好进入组织，解决乙醇与石蜡亲 和性较差的问题，并能增加遮光系数，且与封 藏剂很好混合； 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当

15、之处，请联系本人或网站删除。 2.2.方法：方法： ?（1）透明剂的种类 a.选择的原则：与乙醇和石蜡均有较好的亲和性， 又不破坏细胞结构（形态、结构）不能大量提取 细胞成分 b.种类：二甲苯、氯仿、香柏油，苯胺油，其中以 二甲苯最好 ?（2）透明过程 （乙醇：二甲苯）2:11:11:2纯（二甲 苯）但有时也只用1：1和纯的二甲苯即可，时间要长 （1h）纯的二甲苯要多换几次保证去乙醇完全。 ?（3）时间：随组织块大而异，也与温度有关。一般 为30m2h，如洋葱根尖为每次1h ?（4 4）温度：多常温。 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处

16、，请联系本人或网站删除。 3.注意事项 ?（1）透明要完全彻底除去乙醇或丙酮 ?（2）时间过长会使组织变硬变脆，出现收缩， 过短，透明不彻底，乙醇除不尽，石蜡进入不 好，会出现空洞。 ?（3）换二甲苯是要快，因二甲苯易挥发使浓 度改变 ?（4）盖严防止水分和空气（CO2）进入，出现 混浊和酸度变化因而受酸影响。 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 （六）石蜡透入（六）石蜡透入 1.目的： 让石蜡透入细胞，代替二甲苯支持细胞，增加 强度，防止在切片时细胞变形和破碎，便于切 片。 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供

17、参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 2.透蜡 （1）对石蜡的要求 （2）透蜡的过程 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 （1）对石蜡的要求 熔点已知 质量：结构细腻， 光滑均匀 无灰尘和挥发物； a透明：b无不透明的物；c 无气泡 ?种类：石蜡熔点在4260之间，包埋石蜡在 5060之间，可分为两种软石蜡5256 （动物）硬石蜡5458（植物）浸片 （4um以下）用5660为好。 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当

18、之处，请联系本人或网站删除。 ?石蜡好坏可用以下方法辨别： a.熔入纸盒中无气泡（挥发物；） b.无不透明颗粒（灰尘），断裂处无颗粒 （灰尘，切片无细小颗粒（灰尘） C.在30-35放置24小时无气泡或不透明结 晶状小点。 ?不好石蜡的利用： 加热至开始冒烟后移至火焰较小的的灯上， 再加热数小时，除去挥发物和水分； 冷却后杂质下沉可除去，所以使用过的石 蜡可再重复利用切效果较好。 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 透蜡的过程 ?植物：二甲苯:石蜡纯石蜡 ?50ml烧杯2个 ?1/2二甲苯1/2石蜡石蜡石蜡，根据

19、组 织块的大小，每步20min60min，温度62 ?换蜡的方法：A：移材料： ? B:倒石蜡 ?动植物材料在透蜡的过程中前者时间短后者 时间长，透蜡时以换蜡不转移材料为好。 ?动物：从透明剂中取出透明剂石蜡混合 液（1520min）纯石蜡换一次新鲜 石蜡。（透蜡时间为11.5h）洋葱根尖为1h。 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 3.注意事项：注意事项： （1）透蜡要完全不能残留二甲苯； （2）温度恒定，以较低温度为好，较高温度提取 严重，因为二甲苯和石蜡都是脂类物质容物； （3）时间合适，较短为好，否则会变

20、硬变脆出现 收缩。 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 （七）包埋 1.目的：以石蜡代替细胞中水分变硬，形成含有材 料的石蜡块，体积增大，便于切片也便于保存； 2.方法： （1）石蜡选择同包埋，让透蜡后的组织块包埋在 石蜡中，形成一定的形状。 （2）准备：折纸盒，准备温台（或电热板）和酒 精等及新鲜石蜡，解剖针、标签和一盆冷水 （3）倒蜡 （4） 冷却 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 操作： 纸盒标签加组织倒石蜡拨正 组织块放入

21、水盆沉底 ?盆中放满冷水，点燃温台下的酒精灯或（电热 板），放3个解剖针和纸盒在温台上. ?将标签放入盒底，文字朝下 ?将温箱中取出的石蜡杯，将材料拨入纸盒内， 再倒入新鲜的石蜡，将材料拨到适当位置。 ?将纸盒轻轻提取放入盆面，表面凝固后倾斜使 冷水进入盒中，立即沉入水中迅速冷却， 30min1h可取出，取出蜡条备用。 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 3.注意问题：注意问题： （1）包埋时石蜡不能过早冷却（放在温台上） （2）冷却要快 （3）若出现白色、浑浊结晶，可能是由于： a.脱水不干净； b.组织内部或

22、石蜡中混有透明剂； c.组织块倒入时，周围蜡已凝固： d.石蜡冷却太慢； e.石蜡质量不好。 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 （八）切片（八）切片 1. 目的：将观察的材料变薄，光线容易穿过； 2方法： （1）固定：取出蜡块，修整材料长条形，避 免损伤。然后将底部粘于金属和渗蜡木块上。 （2）修块：修块使切片成蜡带而不弯曲，组 织便于镜检，组织块需要修整齐，最好为梯形、 长方形、正方形。 组织块必须上下平行，但左右的蜡、上下 的蜡不要太多或太少；正方形或长方形，可 各切去一角，以便识别。 文档来源于网络，文档

23、所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 切片：切片： 切片机 结构： A A：微动装置（调节切片厚薄） B B：夹刀部分； C：夹物部分。 两类： 滑行切片机：划刀部分是滑动的；夹物部分 是固定不变的，但可升降； 旋转式切片机：则是夹物部分上下向前移动， 而夹刀部分固定不动，最薄切 2um2um，最厚40um。 ? 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 切片刀： 双平面刀（两面平，两种机型均可） 平凹刀（一面平，一面内凹） 双凹刀（两面都凹） 保安刀片 玻璃

24、刀 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 切片方法 将切片材料的木块夹在刀夹上，厚度一般 612um，连续转4050次，用毛笔挑起蜡带， 平放在蜡光纸上，靠刀的一面较光滑，应向下。 镜检组织细胞是否完整，有无空洞，皱褶， 碎裂等。 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 贴片贴片 ?将烫板加热到35度左右； ?载玻片涂上蛋白甘油，用手涂抹（蛋清：甘油 1：1，加1%的麝香草；滴加蒸馏水数滴，放上 蜡带切断，应短于载玻片的1/5或2/5）将

25、载玻 片移置烫板上，使片展平； ?除去多余水分再放至烫板（35度）23h后即可。 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 3.3.切片中经常出现的问题及其原因切片中经常出现的问题及其原因 ?隔片（太软，刀太钝） ?刀痕（刀有缺口，石蜡中有硬的颗粒） ?脱片（不干净；粘片剂变质；切片光面未向下；切 片太小而厚；组织过硬；切片未充分展开；切片贴 片面未充分干燥（组织部分呈白色）。 ?弯曲（不平行） ?不成带（石蜡太少：温度低） ?卷筒（温度过低，过硬，太钝） ?粘刀：（温度太高，过软，太钝） ?纵裂：（缺口；颗粒，太硬） ?厚薄不均：夹的太松，刀的倾角太大，太硬） 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 （九）染色（九）染色 ?1. 目的：增大反差，增大选择性 ?2. 原理：有两种学说 物理作用： 化学学说：它认为染色深浅完全取决于化学作用所 致如细胞质呈碱性，细胞核呈酸性，红血球呈中性， 因而分别被酸、碱和中性染料亲和而起反应。 ?物理学说和化学学说都较片面，不能全面深入解释许 多现象，如孚尔根反应，既有无色品红与染色质之间 的化学反应，有选择性，但长时期浸入水或酒精中也 会部分或全部