生物可降解塑料

1、.1 第八章 可降解塑料的生物合成 第一节第一节 可降解塑料概述可降解塑料概述 第二节第二节 PHAs的结构、物理化学性质和应用的结构、物理化学性质和应用 2 第一节 塑料废物污染和可降解塑料 q二十世纪七十年代以来塑料工业得到迅猛的发展，无论 是工业、农业、建筑业，还是人们的日常生活无不与塑 料密切相关。 q化学合成塑料在自然环境中很难分解，亦不会被腐蚀， 燃烧处理又会产生有害气体，塑料垃圾对环境造成了巨 大的危害。 3 普通塑料对环境污染的特点 成分为合成树脂成分为合成树脂 (1)污染范围广污染范围广 (2)污染物增长量快。污染物增长量快。 全世界每年对塑料的需求量为1亿吨。 美国专家估计

2、每10年产量将增加1倍。 1995年我国的塑料需求量为600万吨，其中对环境有威 胁的地膜为88万吨，包装用品为150-200万吨。 美国、日本的塑料垃圾占垃圾总量的7%。 4 普通塑料对环境污染的特点-续 (3) 处理难处理难。塑料具有耐酸碱、抗氧化、难腐蚀、难降解的 特性，埋地处理百年不烂；燃烧时产生大量有毒气体， 如HCl、SOx、CO等。 5 普通塑料对环境污染的特点 (4)回收利用难回收利用难。塑料制品种类多，填料、颜料多样，难以 分拣回收再利用。 (5)生态环境危害大生态环境危害大。地膜降低耕地质量，农作物植株矮小， 抗病力差。 6 q 研究和开发生物可降解塑料已迫在眉捷 q 用可

3、生物降解塑料代替部分石油化工合成塑料，禁用 某些塑料制品 如意大利已立法规定自1991年起所有包装用塑料都 必须生物可降解，我国也已开始考虑禁用塑料方便 餐盒等不可降解的塑料制品。 生物可降解塑料 7 国内外出现的生物可降解塑料 PCL-聚已内酰胺聚已内酰胺;PVA-聚乙烯醇聚乙烯醇;PE-聚乙烯聚乙烯 8 生物可降解塑料的特点 q工艺简单 q生产过程污染轻 q生物可降解性和生物可相容性 q可进行高分子材料的结构调整：控制营养、环境 条件 9 第二节、PHAs的生物合成与应用 q 采用微生物发酵法生产的聚-羟基烷酸(简称PHAs)， 成为应用环境生物学方面的一个研究的热点 聚-羟基丁酸PHB

4、3-羟基丁酸与3-羟基戊酸的共聚物P(3HB-co- 3HV)或PHBV 10 qPHAs除具有高分子化合物的基本特性，如质轻、 弹性、可塑性、耐磨性、抗射线等外，还具有生 物可降解性和生物可相容性。 PHAs 香波瓶 100年 个月 合成塑料 PHAs 原原 料料 降降 解解 11 一、PHAs的结构、物理化学性质和应用 q 多种微生物在一定条件下能在胞内积累PHAs作为碳源和 能源的贮存物。 q 由于PHAs具有低溶解性和高分子量，它在胞内的积累不 会引起渗透压的增加，是理想的胞内贮藏物，比糖原、 多聚磷酸或脂肪更加普遍地存在于微生物中。 qPHAs的通式可写成： 2 _ _ _ _ _

5、R C _ O n _ _ OCH CH 单体数目 12 R为甲基时，单体为-羟基丁酸(HB)； R为乙基时，单体为-羟基戊酸(HV)； R为丙基时，单体为-羟基已酸(HC)； R为丁基时，单体为-羟基庚酸(HH)； R为戊基时，单体为-羟基辛酸(HO)； R为已基时，单体为-羟基壬酸(HN)； R为庚基时，单体为-羟基癸酸(HD)； R为辛基时，单体为-羟基十一酸(HUD)； R为壬基时，单体为-羟基十二酸(HDD)； nR多为不同链长正烷基，也可以是支链的、不 饱和的或带取代基的烷基 13 聚合物命名 qR为甲基时，其聚合物为聚-羟基丁酸(PHB) qR为乙基时，其聚合物为聚-羟基戊酸(P

6、HV) q 在一定条件下两种或两种以上的单体还能形成共聚物， 其典型代表是3HB和3HV组成的共聚物P(3HB-co-3HV)。 14 q 每个PHAs颗粒含有数千条多聚体链。这些多聚物的物 理化学性质和机械性能如韧度、脆性、溶点、玻璃态 温度和抗溶剂性等与单体的组成有极大的关系。 例如PHBV共聚物中羟基戊酸组分的增加可使熔 点从180(PHB均聚物)降至75(PHBV共聚物中 HV组分的摩尔分数为3040%) 。 PHAs的结构、物理化学性质 HV -羟基戊酸 15 q 大多数有关细菌PHAs的物化性质的研究是针对PHB和 PHBV两种聚合物进行的。 qPHB是高度结晶的晶体，结晶度的范围

7、在5580%， 其在物理性质甚至分子结构上与聚丙烯(PP)很相似， 例如熔点、玻璃态温度、结晶度、抗张强度等，而比 重大、透氧率低和抗紫外线照射以及具有光学活性、 阻湿性等则是PHB的优点，见表7-2-1。 PHAs的结构、物理化学性质-续 16 17 qPHB较脆和发硬，但可通过与适量HV共聚而补偿。 q 随着PHBV中HV组分的增加，聚合物的劲度降低而韧性 增加，且共聚物的熔点随着HV组分的增加而降低，使得 较易对其进行热加工处理。 q 单体4HB的聚合物或3HB与4HB的共聚物P(3HB-co-4HB) 则是高弹体，且其生物降解的速度比均聚PHB或PHBV更 快。 PHAs的结构、物理化

8、学性质-续 HV -羟基戊酸 HB -羟基丁酸 18 PHB的工业化应用主要存在两个缺点 qPHB较差的熔化稳定性，其分解温度约为200 ，该温 度与其熔点相近(约175 )； 可通过在发酵过程中加入3HV的前体合成PHBV共 聚体或将PHB与其它多聚物相混合使用来解决； q 在环境条件下贮存数日后，PHB易发脆。 PHB的老化问题可通过简单的淬火处理来较大程度 地解决。 19 思考题 q含有PHAs的微生物能通过什么染料鉴别？ q能利用糖蜜生产PHB的最有效菌株是什么？ q工业生产PHAs的微生物菌种需要考虑哪些因素？ q目前报道利用葡萄糖基质生产PHB的最高记录是 多少？ q一般发酵过程分

9、为哪两个阶段？ 20 PHAs的应用的应用 shampoo bottles bicycle helmet 21 二、PHAs的生物合成 q合成PHAs的主要微生物 q合成PHAs的主要基质 qPHAs的代谢途径与调控 22 PHAsPHAs的生物合成的生物合成 一一 合成合成PHAs的主要微生物的主要微生物 1 PHAs的发现及形成机制的发现及形成机制 PHB最初由最初由 Lemoigne于于1925年首先发现。从年首先发现。从 巨大芽孢杆菌巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium)分离鉴定。分离鉴定。 阐明该菌阐明该菌形成芽孢时产生形成芽孢时产生PHB。 20世纪世纪50年代，发

10、现年代，发现PHB的生成量的生成量随培养基中随培养基中 碳氮比的增加而增加碳氮比的增加而增加 23 q 能产生PHAs的微生物分布极广，包括光能和化能自养及 异养菌计65个属中的近300种微生物。 q 目前研究的较多的微生物： 产碱杆菌属(Alcaligenes europhus, 现在更名为Ralstonia eutropha) 假单胞菌属(Pseudonomas) 甲基营养菌(Methylotrophs) 固氮菌属(Azotobacter) 红螺菌属(Rhodospirilum) （一）合成PHAs的主要微生物 24 活性污泥中微生物产生的PHB 25 表表7-4 各种微生物利用不同碳源合

11、成各种微生物利用不同碳源合成PHVs的情况及水平比较的情况及水平比较 26 选择工业生产选择工业生产PHAs的菌种考虑的因素：的菌种考虑的因素： 能利用廉价碳源的能力能利用廉价碳源的能力 生长速率问题生长速率问题 多聚物合成速率多聚物合成速率 在细胞内最大量积累多聚物的能力在细胞内最大量积累多聚物的能力 27 英国英国ICI公司进行考察，发现公司进行考察，发现： 固氮菌固氮菌：产生多糖，：产生多糖，PHB的比产率降低，技术问题。的比产率降低，技术问题。 甲基营养菌甲基营养菌：PHB产率中等。产率中等。 真养产碱杆菌真养产碱杆菌：生长快，易培养、胞内：生长快，易培养、胞内PHB含量高、含量高、

12、聚合物分子量大并能利用各种较经济的能源。聚合物分子量大并能利用各种较经济的能源。 最终选择了最终选择了 真养产碱杆菌（真养产碱杆菌（A . eutrophus） ICIImperial Chemical Industries帝国化学工业公司帝国化学工业公司 28 q 真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha)为革兰氏阴性的兼性化 能自养型细菌 积累PHB可达细胞干重的90%以上 能利用糖加丙酸或戊酸产生P(3HB-co-3HV) 改变基质该菌还能将4HB和5HV结合到3HB的结构中 去，形成4HB或5HV单体与3HB的共聚物。 q采用带有真养产碱杆菌PHB合成基因的重组大肠杆菌 (E

13、.coli) 。 工业化生产PHAs的微生物 29 带有带有A.eutrophus PHB合成基因合成基因的的 重组重组E.coli 成为新的选择成为新的选择！ A.eutrophus重组重组E.coli 1 生长快，容易培养（培养条件简单）生长快，容易培养（培养条件简单） 2 胞内聚合物含量高胞内聚合物含量高 3 聚合物分子量大聚合物分子量大 4 提取相对较困难提取相对较困难 5 生产共聚物较容易，易调节共聚比生产共聚物较容易，易调节共聚比 6 分子量分布控制较难分子量分布控制较难 7 已有工业化产品已有工业化产品 1 发酵周期短发酵周期短 2 胞内聚合物积累量大胞内聚合物积累量大 3 胞内

14、无聚合物降解酶，分子量大胞内无聚合物降解酶，分子量大 4 易于提取易于提取 5 胞内聚合物颗粒大、结晶度高胞内聚合物颗粒大、结晶度高 6 能利用多种碳源能利用多种碳源 7 在复杂培养条件下，胞内聚合物才能高积在复杂培养条件下，胞内聚合物才能高积 累。累。 8 有较成熟的高密度细胞培养技术有较成熟的高密度细胞培养技术 生产生产PHB(V)的的A.eutrophus 和重组和重组E.coli 特点特点 30 二二 合成合成PHAs PHAs 的主要基质的主要基质 1 1 糖质碳源糖质碳源 2 2 甲醇甲醇 3 3 气体（气体（H H2 2 、 、COCO2 2、 O O2 2 ） 4 4 烷烃及其

15、衍生物烷烃及其衍生物 31 1 糖质碳源糖质碳源 葡萄糖葡萄糖 A.eutrophus的变异株利用葡萄糖已用于工的变异株利用葡萄糖已用于工 业生产业生产PHB。Kim等人采用等人采用细胞密度培养细胞密度培养的的 方法，方法，50h细胞浓度达细胞浓度达164g/L，干细胞中，干细胞中 PHB含含76，PHB生产强度为生产强度为2.42g/(L.h) 是目前世界上已报道的是目前世界上已报道的最高记录最高记录. 32 重组重组E.coli 利用丰富酵母膏、蛋白胨的葡萄糖培养基培养，利用丰富酵母膏、蛋白胨的葡萄糖培养基培养， 42h细胞浓度达细胞浓度达117g/L，PHB占细胞干重占细胞干重76， P

16、HB生产强度生产强度2.11g/(L.h) 降低成本，用合成培养基培养降低成本，用合成培养基培养35h，细胞浓度为，细胞浓度为 71.4g/L，PHB干重干重22.8。即。即 在合成培养基上在合成培养基上 不能大量积累不能大量积累PHB（乙酰（乙酰CoA不足）。不足）。 在合成培养基上加有机氮源，改进方法，细胞浓在合成培养基上加有机氮源，改进方法，细胞浓 度达度达116g/L，PHB干重达干重达62.2。 33 蔗糖和糖蜜蔗糖和糖蜜 带有稳定高拷贝数的带有稳定高拷贝数的pSYL104质粒的重组质粒的重组 E.coli 能利用蔗糖生产能利用蔗糖生产PHB。 在含蔗糖的合成培养基中采用恒定在含蔗糖

17、的合成培养基中采用恒定pH的分批补的分批补 料方式培养料方式培养48h，细胞浓度达，细胞浓度达124.6g/L, PHB 浓度浓度34.3g/L。加有机氮可以改善。加有机氮可以改善。 利用糖蜜原料有困难：杂质多，利用糖蜜原料有困难：杂质多，PHB难积累。难积累。 需精制后使用。需精制后使用。 34 2、甲醇 q 甲醇是最便宜的基质之一， qICI拥有生产甲醇单细胞蛋白的技术经验，曾考虑用甲醇 作基质生产PHB。甲醇菌积累PHB含量不高，PHB回收成 本大，获得的PHB的分子量较小，故放弃该路线。 q 但可以作为寻求新的菌种和开发更有效的培养方法的途径。 35 36 3、气体、气体H2/CO2/

18、O2 q 真养产碱杆菌等一些爆鸣气细菌能利用H2/CO2/O2产生 PHB，其中H2作为能源，CO2是碳源。 q 以H 2作为基质按其价格和产率而言(见表1)在经济上是 划算的，且H2又是一种干净的可再生资源。可以同时 解决两个严重的环境污染问题：温室效应及废弃的非 降解塑料对生态环境的危害。 q 安全性问题：解决混合气体爆鸣的安全问题和气体的 循环利用问题。控制基质气相中氧的浓度低于气体爆 炸的下限(6.9%)是安全的。 37 4、烷烃及其衍生物、烷烃及其衍生物 q 假单胞菌能利用中等链长的烷烃或其衍生物醇、酸等 产生中等链长羟基烷酸的共聚物(PHAMCL)，共聚物 中单体的组成与基质碳架的

19、长度有关。 q 以辛烷作基质连续培养食油假单胞菌(P. oleovorans)， 稳定态细胞浓度11.6g/l，PHA的生产强度为0.58g/Lh， 38 （三）PHAs的代谢途径与调控 qPHAs的产生机理的产生机理 微生物在碳源过量而其他营养如氮、磷、镁或氧不足 时，积累大量PHAs作为碳源和能源的贮存物，或作为 胞内还原性物质还原能力的一种储备。 当限制性营养物再次被提供时，PHAs能被胞内酶降解 后作为碳源和能源利用。 39 胞中积累的PHAs存在形式 以单个粒子的形态存在，每个细胞含有的颗粒 数量的大小随微生物种类而不同，在Ralstonia eutropha中，每个细胞含有8-10

20、个颗粒，每个颗 粒直径大小为0.2-0.5m； 以非晶体形式存在。具有高度的折光性，颗粒 外面包裹着一层膜，没有生物膜那样的典型双 层结构，膜中含有PHAs合成酶的降解酶系统。 40 Scanning electron microscope of PHB granules in Ralstonia eutropha 41 补料分批培养补料分批培养45h收获的菌体收获的菌体 细胞的电镜照相细胞的电镜照相 42 PHAs的代谢途径的代谢途径 n 不同微生物合成PHAs的途径不同，基质不同其合成途径 也有差异(图7-2) 。 真养产碱杆菌及多数细菌从糖合成PHB； 深红红螺菌从糖合成PHB； 食油假

21、单孢菌等从链烃、醇及酸合成具有与基质链长有关的HA单 位的PHAs； 一株产碱杆菌从长链偶碳脂肪酸合成PHB； 铜绿假单孢菌等从糖质碳源(如葡萄糖酸)合成具中链HA单位的P HAs； 真养产碱杆菌等利用糖加丙酸合成PHBV。 HA-羟基烷酸羟基烷酸 43 A 44 PHAs的生物合成和降解同时存在 q的 丁酰丁酰CoA 45 基因重组细菌 q 20世纪80年代后期开始将重组DNA技术应用于生物合 成PHB，来自于多种细菌的PHA生物合成酶PHA生 物合成途径的关键酶，已被在分子水平进行了详细的研 究， PHA生物合成酶基因已被克隆成功。 q3个实验室独立地将真养产碱杆菌H16的PHB生物合成基

22、 因phbA、phbB和phbC克隆并在大肠杆菌中表达。 46 基因重组细菌 q研究发现，在真养产碱杆菌中，PHA合成酶的结构基因 排列在称为phbC-A-B的一个操纵子上，分别编码PHA合 成酶、-酮基硫酯酶和依赖于NADPH的乙酰乙酰CoA还 原酶(见图7-4)。 47 三、三、PHAs的发酵生产的发酵生产 qPHAs实现大规模工业化生产的主要障碍是生产成本。 英国帝国化学公司(ICI)认为影响PHAs生产成本的主要 因素有 菌种 原料 操作方式 提取方法 48 因而降低PHAs的生产成本主要措施 q(1)采用廉价基质(如CO2 、H 2 和O 2，甲醇，乙醇，葡萄 糖及来自农业废物的有机

23、酸等)和提高产物对基质的产 率系数，降低发酵原材料的成本； q(2)提高生产强度(如选育高产菌株、采用合适的发酵生 产方式等)，以降低操作成本； q(3)改进提取、纯化技术(如不采用价格昂贵的有机溶剂、 简化操作等)，以降低提取成本。 49 PHAs的流加发酵 q选定了较适宜的菌种、基质和提取方法后，要进 一步降低PHAs的生产成本，最主要的关键在于采 取适当的发酵方式，以获得高的产物转化率、高 的产物浓度。采取适宜的发酵生产方式是提高聚 合物的生产率和改进其质量的关键。 50 PHAs的流加发酵的流加发酵 q 在PHAs的生产中，通常采用分批发酵法和流加发酵法，有时用连续 培养法来获得高的生

24、产强度。 q 由于真养产碱杆菌只有在某种营养成份氮、磷或氧等缺乏而碳源过量 的不平衡生长条件下才能大量积累PHAs，一般可将发酵过程分成两 个阶段来进行控制： 第一阶段为菌体细胞的形成阶段，在此阶段微生物利用基质形成 大量菌体，而多聚体PHAs的积累量很少； 第二阶段为多聚体形成阶段，当培养基中某种营养耗尽时，细胞 进入PHAs形成阶段，在此阶段PHAs大量形成而菌体细胞基本上 不繁殖。 51 q采用流加发酵法进行PHAs的生产时，可以在某些 必须的营养成分成为生长限制性因素之前，对其 进行定量流加，延长细胞的对数生长期，从而可 以获得较高的菌体浓度。 52 q 减少菌体细胞在生长阶段积累多聚

25、体，也需通过流加法来 控制，培养液中氨离子浓度不小于200 mg/L，否则会降低 共聚体的最终产率。 q 在多聚体形成阶段，限制氮源能刺激细胞积累PHAs，但氮 源的完全缺乏会极大地损害微生物细胞的合成活性，所以 将在PHAs合成阶段以较低的速率限量流加氮源。与分批发 酵中氮源完全缺乏相比，流加发酵细胞中的PHAs含量增加 更快。 PHAs的流加发酵的流加发酵 53 q此外，与传统的分批发酵相比，流加发酵通常具 有染菌和退化的几率小，可以获得较高的转化率， 对发酵易实现优化控制等优点。 54 1、采用流加培养法生产PHB （1）选择限制培养基中的氮源作为流加控制的手 段，可以提高PHB产率；

26、（2）控制碳氮比相当重要。 55 2、采用流加培养法生产共聚物P(HB-CO-HV) 聚羟基烷酸（PHAs）是一类具有广泛工业应 用价值的耐热塑料，某些共聚物PHA比均聚物 PHB具有更有用的热机械性能，如PHB较脆和发 硬，而HB和HV形成的共聚物PHA比PHB的硬度 降低而韧度增加。 56 q在共聚物P(HB-CO-HV)的生产过程当中，流加发 酵比分批发酵具有明显优势。丙酸和戊酸是生产 共聚物P(HB-CO-HV)所必需的基质，由于这些有 机酸对菌体细胞具有一定的毒性，故采用简单的 分批发酵不可能获得高产，采用流加培养法，可 以避免由于培养基中有机酸的积累而使细胞活力 受到损害，从而达到

27、提高P(HB-CO-HV)产率的目 的。 57 q另外为了减少菌体细胞在生长阶段积累多聚体， 也需通过流加的方法来控制培养液中铵离子浓度 不小于200mg/L，否则会降低共聚体的产率。 58 （三）流加培养条件对多聚体相对分子量的影响 多聚体的相对分子量常常影响其质量和生物降解的速 度。 不同用途对生物可降解多聚体的平均相对分子质量大 小要求不同，一般来说平均相对分子质量大且相对分子质 量分布范围窄的多聚体具有更广泛的工业应用前景，并且 提取也较为方便。 59 多聚体的平均相对分子量大小受流加培养条 件的影响。当培养条件恒定时，其平均相对分子 量也保持相对恒定，因而只要控制适宜的流加培 养条件

28、，就可以将相对分子量控制在所需的范围 之内。 60 对于共聚物P(HB-CO-HV)而言，由于大多数 微生物即使在氮源和磷等因素不受限制的细胞生 长阶段也能在胞内积累少量的PHB，因而在加入 任何能激发其形成共聚体的基质时，菌体胞内已 含有一些均聚物PHB，因而得到的是各种HV单体 含量的共聚体的混合物。 61 q 为了得到更均质的共聚体，在共聚物P(HB- CO-HV)的积累阶段开始时，应先使培养物处于 碳源饥饿状态，这样使细胞内源PHB的量大大降 低，得到的共聚物也就较为均一。 62 q另外，共聚体中HB/HV单体比例依赖于流加过程 中糖/丙酸或者丁酸/戊酸的比例，且基质流加速 率应小于其

29、最大可能的利用速率，以避免对细胞 有毒性的基质的积累，确保产生的共聚物具有恒 定的HB/HV比例。 63 第四节 PHAs的提取 qPHB的提取涉及到两个方面的问题：一是方法的 合理性，主要表现在提取率、产物的纯度，提取 过程是否对PHB的结构产生影响，以及是否方便 操作，预后处理是否复杂、环境是否污染等方面。 二是过程的经济性，表现在提取的材料的费用、 能量的消耗和设备的投资等。 64 四、四、PHAs的提取技术的提取技术 q有机溶剂法 q次氯酸钠提取法 q酶法 q表面活性剂-次氯酸钠法 q其他方法 65 1. 有机溶剂法 q 对于由真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha)生产P

30、HB，研 究初期通常采用的提取方法是有机溶剂法。包括 : 氯 仿、二氯乙烷、1,1,2三氯乙烷、乙酸酐、碳酸乙烯 酯及碳酸丙烯酯等。 q 原理：有机溶剂一方面能改变细胞壁和膜的通透性， 另一方面能使PHB溶解到溶剂中，而非PHB的细胞物 质(NPCM)不能溶解，从而将PHB与其它物质分离开来。 具体操作步骤如图7-5所示。 66 图7-5 有机溶剂提取PHB的过程示意图 67 (1)当溶剂中含有超过5%(w/v)的PHB时，溶液变得很粘，要 去掉细胞的残余物就变得很困难； (2) 提取率难以达到很高； (3)使用大量的有机溶剂； (4)造成严重环境污染，操作不便。 优点：优点：引起PHB的降解

31、非常小，得到PHB的纯度非常高。 因此，用有机溶剂提取PHB通常作为一种实验室方法。 有机溶剂的方法的缺点 68 2 次氯酸钠提取法 q 次氯酸钠能够破胞且对细胞中的非PHB的细胞物质的 消化很有效，因而用该方法破胞所得产品的纯度较高、 提取速度快，避免了有机溶剂提取过程中繁琐的前、 后处理工作。 q 但是PHB分子量只有原来的一半。 q 具体操作过程见图2。 69 图2 次氯酸钠提取PHB过程示意图 70 次氯酸钠提取法 优点：不使用大量的有机溶剂。 缺点：次氯酸钠对PHB分子有严重的降解作用，因 而所获得的PHB的分子量较小。 71 次氯酸钠次氯酸钠/ /氯仿提取法氯仿提取法 改进：根据氯

32、仿提取时PHB纯度高且被降解程度小， 而次氯酸钠对非PHB细胞物质消化很有效的优点， 结合PHB疏水亲油物质，而细胞膜具有亲水性的 特点的原理，发明了用分散的次氯酸钠/氯仿提 取PHB的方法。 72 冷冻干燥的菌体冷冻干燥的菌体+次氯酸钠次氯酸钠+氯仿破壁氯仿破壁 离心离心 分离分离 氯仿相中加入非溶剂物质使氯仿相中加入非溶剂物质使PHB沉淀沉淀 离心过滤分离离心过滤分离 烘干烘干 成品成品 73 q在该方法中次氯酸钠主要起破胞作用，而氯仿则 对破胞产生的PHB起保护作用，因而不但可得到 较高纯度的PHB，而且PHB被次氯酸钠降解的程 度大大降低。同时由于破胞较完全，因而可以获 得较好的提取收

33、率。 74 q优点：提取率较高，得到的PHB的分子量较大。 q缺点：需要大量的有机溶剂，并且操作复杂，限 制了工业化生产。 75 三、酶法三、酶法 基本原理与次氯酸钠法相似，即让大量的 NPCM溶解而PHB不溶解，从而达到分离提纯的目的。 但是由于NPCM通常包括核酸、类脂物、磷脂、肽 聚糖以及蛋白质等物质，因此实际上是通过多种 酶的多步或协同作用来达到消化NPCM的目的。 76 单独的使用酶来消化细胞中的杂质物质，所 得到的PHB的纯度不高，往往要结合其他的方法， 例如再用表面活性剂处理，才能得到较高纯度的 PHB。该法包括细胞的热处理、酶处理和阴离子表 面活性剂处理等步骤，因此操作十分复杂

34、。 77 由于细胞杂质成分比较复杂，特别是酶作用 的条件比较苛刻，需要处理的步骤较多、操作较 为复杂，因此酶法的应用在提取成本、过程放大 方面受到了很大的限制。 78 四、表面活性剂四、表面活性剂/ /次氯酸钠法次氯酸钠法 基本原理：当表面活性剂浓度较低时，其单个分子进 入到细胞膜的磷脂双层中；随着表面活性剂浓度的增加， 更多的表面活性剂分子结合到磷脂双层中，细胞膜的体积 就会不断的增大；一旦磷脂双层中的表面活性剂饱和，再 增加表面活性剂就会使细胞膜收到破坏，表面活性剂与磷 脂形成大量的胶团，胞内PHB物质释放出来。 79 冷冻干燥菌体表面活性剂破胞冷冻干燥菌体表面活性剂破胞 离心过滤离心过滤

35、 分离分离 次氯酸钠洗涤次氯酸钠洗涤 离心过滤分离离心过滤分离 水洗水洗 离心过滤分离离心过滤分离 烘干烘干 产品产品 80 该方法能够比较方便的实现在水相中提取PHB， 这是它的突出优点，但要使用大量的表面活性剂， 而且次氯酸钠的使用不可避免的造成了PHB的降 解。 81 五、其他方法五、其他方法 基因工程技术重组大肠杆菌生产PHB的方法， 用氨水从这类细胞中提取PHB就是其中的一种方 法。 82 各种提取各种提取PHB的方法比较的方法比较 83 （一）降解机制（一）降解机制 1 1 胞内降解胞内降解 q胞内PHB的代谢是个循环过程。 q 图7-9中第四步到第七步是降解过程。首先(第四步)胞

36、 内无定形PHB颗粒在解聚酶作用下降解，形成单体和 二聚体的混合物。二聚体随之在二聚体水解酶作用下 形成单体。 五、五、PHAs的生物降解的生物降解 84 三羧酸循环 柠檬酸 乙酰乙酰CoA 乙酰乙酸 3羟基丁酸CoA 聚羟基丁酸 乙酰CoA 草酰乙酸 3-酮硫解酶 羟基丁酸 (PHB) 乙酰乙酰CoA 还原酶 还原酶 羟基丁酸 图图7-9 PHB的代谢过程的代谢过程 85 2 胞外降解胞外降解 q 聚羟基丁酸(PHB)的胞外降解有两种机制， 在无菌条件下通过水解进行。这种机制对于PHB在医 疗方面的应用(如作为药物的缓适载体、手术缝线等)特 别重要。 在自然环境中，是酶降解机制。许多细菌和真

37、菌可分 泌外解聚酶，有些甚至可以利用PHB作为唯一碳源生 长。 86 （二）（二）PHB在环境中的降解在环境中的降解 q 影响PHB降解速度的因素较多 包括环境类型：微生物种群及活力，水份，温度 塑料制品性质：厚度，表面组织形态，孔隙度，制 品中的第二组分,如填充料、颜料 q 在自然环境中，能降解PHB的微生物包括细菌、放线 菌、和霉菌等。 J.Mergaertd等在土壤中发现有295种微生物可降解 PHB，包括105种革兰氏阴性菌，36种革兰氏阳性菌， 68种放线菌和86种霉菌。 87 研究表明，在一定的范围之内，PHB的降解 速度与温度呈正相关，其降解可以分为两个阶段。 第一阶段相对分子量下降；第二阶段是相对分子 量下降到13000后开始腐蚀。 88 环境中有许多微生物能降解PHB，但每种的数 量不一定很多，活力不一定很高。当PHB出现在 环境中后，经过一定的迟滞期，能降解的PHB的 微生物会逐渐增多，活力升高，降解的速度增快。 89 表7-10 PHB在环境中的降解在环境中的降解 90 q 通常情况下，PHB厌氧降解比有氧降解快 真养产碱杆菌在厌氧条件下，主要代谢产物是乙