大一班幼儿卫生习惯的培养总结

1、 细胞成像Cellimaging2018November23 细胞成像讲座内容1.细胞成像的原理和应用2.细胞成像的实验流程3.细胞成像的实验设计4.细胞成像的常见问题解析2018November23细胞成像的原理通过巧妙结合免疫反应的特异性，实现在组织、细胞、亚细胞原位水平检测各种抗原物质。 抗原二抗一抗标记201Novembe23荧光显微成像 活细胞成像imagingLivecell细胞免疫荧光ICC/IF显微镜下的图像来研究通过连续采集?使用抗体对细胞中目标抗原进行定位、?活细胞的结构与功能定性或定量分析2018November23 细胞成像的发展荧光素成像技术荧光显微镜FITC/TRI

2、TC/PE共聚焦显微镜Cy2/Cy3/Cy5超分辨率荧光/Alexa Fluor?显微技术DyLight?DotQuantumMolecularProbes,Inc,aofisFluorAlexaa registered trademarkThermoFisher Scientific Company.? 2018November23细胞成像的应用细胞免疫荧光的应用Immunocytochemistry/immunofluorescence定性、定观察目标蛋白表达丰度?量定位观察亚细胞定位?定位观察蛋白的共定位?定量很好的药物筛选模型? 2018November23细胞成像的应用：观察目标蛋白

3、表达丰度1. DNPDMSOCLUDAPIDAPICLUMMP-9mergeMMP-9mergeOncotarget,Vol.7,No.201Novembe23细胞成像的应用：观察目标蛋白的亚细胞定位2. StemCells.2012October ;30(10):20652075.doi:10.1002/stem.1139201Novembe23细胞成像的应用：观察细胞显微结构3. STOM超分辨显微镜KeXu,GuishengZhongetat.,201201Novembe234.细胞成像的应用：观察蛋白的共定位 Journal ofvirology,July1998,p. 5717-57

4、2201Novembe23细胞成像的应用：药物筛选模型5. Ascreeningapproach.Screenscanbecarriedout incellsby examiningmultipleproteinmarkersandfunctional changes(forexample, cell morphology)usingautomatedhigh-contentimaging.Xuetal,Nature,200201Novembe23 细胞成像讲座内容1.细胞成像的发展和原理2.细胞成像的实验流程3.细胞成像的实验设计4.细胞成像的常见问题解析2018November23 细胞成

5、像的实验流程固定封闭通透blockingpermeabilizationfixation一抗孵育复染和封片二抗孵育AbAbcounterstaining/SecondaryPrimaryincubationmountingincubation 2018November23细胞成像的实验流程样本固定 复染和封片一抗孵育二抗孵育固定封闭通透counterstaining/AbPrimaryAbSecondaryblockingpermeabilizationfixationmountingincubationincubation固定：有效维持细胞的形态，结构与组分。保存”使细胞被“和稳定在接近生理

6、培养的状态。Live cellimaging活细胞成像不要固定细胞2018November23 细胞成像的实验流程样本固定有机溶剂交联试剂甲醇甲醛溶液乙醇多聚甲醛丙酮戊二醛?交联试剂有利于保护细胞结构，但是会产生蛋白交联，可能会降低抗原性预冷的有机溶剂固定会吸去脂类使细胞脱水、蛋白变性，这种固定方法不需要额外的通透步骤?2018November23细胞成像的实验流程样本固定细胞膜定位case1.固定方式的不同:DAPITubulinMergeITAM 100%Methanol 4% PFA2018November23细胞成像的实验流程样本固定细胞膜定位:case2.固定方式的不同MergeTu

7、bulinY1068)(phosphoEGFRDAPI 100%Methanol 4% PFA2018November23(ab32430)Y38antibodyY1068)(phosphoAnti-EGFR例：细胞成像的实验流程样本通透 复染和封片一抗孵育二抗孵育固定封闭通透counterstaining/SecondaryAbPrimaryAbblockingpermeabilizationfixationmountingincubationincubation通透化1.当抗体检测细胞内蛋白时（包括抗原表位在胞内段的跨膜蛋白），需要对细胞进行通透。2.将样品在含0.1-0.2%Triton

8、X-100的PBS中孵育10分钟。3.使用预冷的丙酮固定则不需要通透。2018November23细胞成像的实验流程样本封闭 一抗孵育二抗孵育复染和封片固定封闭通透counterstaining/SecondaryPrimaryAbAbblockingpermeabilizationfixationmountingincubationincubation?封闭非特异性结合可用10%血清，5%BSA,或ProteinBlock(ab156024)；使用?Biotin标记物,需要封闭内源Avidin、Biotin,可用EndogenousAvidin/BiotinBlockingKit(ab642

9、12)；?使用荧光标记物,当使用甲醛固定时，用含0.3M甘氨酸的封闭液封闭,也可以选用相应的荧光蛋白封闭液,如FITCProtein BlockingAgent(PBA)(ab128980)2018November23细胞成像的实验流程一抗孵育 复染和封片二抗孵育一抗孵育固定封闭通透counterstaining/AbSecondaryAbPrimaryblockingpermeabilizationfixationmountingincubationincubation浓度梯度确定抗体的最佳工作浓度，使特异性染色最大化并减少背景?避免抗体反复冻融，降低抗体效价?室温孵育2?小时或4孵育过夜

10、使用1%BSAinPBS?作为抗体稀释液建议浓度2018November23细胞成像的实验流程二抗孵育 一抗孵育二抗孵育复染和封片固定封闭通透counterstaining/SecondaryAbPrimaryAbblockingpermeabilizationfixationmountingincubationincubation?二抗一般带有荧光素，注意避光保存?确定合适的浓度，避免无信号或背景过高?一般室温孵育半小时以上?多蛋白检测时，选择偶联不同荧光素的二抗，避免串色2018November23 细胞成像的实验流程二抗选择?一抗的种属来源：rabbit;mouse;chicken;ra

11、t等一抗的抗体亚型：IgG;?IgM;IgA;IgY，IgE ab150061Donkey Anti-RabbitIgGH&L(AlexaFluor? 488)preadsorbed一抗的种RabbiIgH&一抗的亚实验应AlexFluor?48是否需要预吸附Preadsorbed?RatMouse,Minimalcross-reactivity:Human,AlexaFluorisaregisteredtrademarkofMolecularProbes,Inc,aThermoFisherScientificCompany.?2018November23）的二抗预吸附（Pre-adsorbe

12、d排除二抗与不同种属的一抗结合，减少非特异性结合，降低背景。 ?PreadsorbedAlexaFluor? 405conjugatedsecondary antibodiesPreadsorbed AlexaFluor?488conjugatedsecondary antibodies?PreadsorbedAlexaFluor? 555conjugatedsecondary antibodies?PreadsorbedAlexaFluor? 594conjugated?secondary antibodiesPreadsorbedAlexaFluor? 647?conjugatedseco

13、ndary antibodies?Pre-adsorbedHRPconjugatedsecondary antibodiesPre-adsorbed?biotinylatedsecondary antibodies2018November23细胞成像的实验流程复染和封片 复染和封片二抗孵育一抗孵育固定封闭通透counterstaining/PrimaryAbSecondaryAbblockingpermeabilizationfixationmountingincubationincubation封片剂 维持样品状态，防止样品变干?防荧光淬灭?），Refractive Index高折射率（?提

14、高图像的分辨率；ab104139的防荧光淬灭封片剂DAPI含2018November23抗体质量问题 抗体质控的金标准 敲除验证特异RabMA灵敏抗一致重组技术2018November23抗体的金标准特异性 个产品结果敲除验证：1500Wild-typeHAP1cells Ki67knockoutHAP1cells-Anti-Ki67antibodyEPR3610(ab92742)genome-editingCRISPR/Cas9Anti-alphaTubulin抗体DM1A -Microtubule-Marker(AlexaFluor?594)(ab195889)2018November23

15、抗体的金标准灵敏性个产品结果：13000RabMAbHigh KddistributoRabMAbAffinityPolRabbit MousemAbLowLowHighSpecificity2018November23抗体的金标准灵敏性Her2E-CadherinCDX2 Rabbitmonoclonal Mousemonoclonal抗体的金标准一致性重组抗体：13000个产品结果 重组抗体?稳定持续供货?批间差异小?生产周期短2018November23抗体的金标准一致性 lung ofIHCbatchtestinghumananti-PD-L1 NSCLCstainedwithg/mL.2at(ab205921)different =control,BF=Ashowed batches.All batchesresults.consistentplc.Abcam2013?Cwww蛋白数据库这个数据库是关于该蛋白的详细信息介绍，比如翻译后修饰、亚细胞定位、组织特异性等，也可 数据库链接以找到Atl