蛋白质组技术实手

1、第一部分 组织和细胞蛋白样品的制备 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 组织和细胞的来源： 1.1.2 仪器设备 机械组织匀浆器 低温高速离心机 (40,000 g) 超速离心机 超生细胞破碎仪 超纯水装置 1.1. 3 试剂 三氯醋酸 (TCA) 丙酮 二硫苏糖醇 (DTT) 尿素 CHAPS PMSF EDTA 乙醇 磷酸 考马斯亮蓝 R350 抑肽素 A 亮肽素 试剂纯度均应是分析纯或以上。 1.1.4溶液配制 PBS: NaCI 8g, KCI 0.2g, Na 2HPO4 1.44g, KH 2PO4,溶于 800 ml 水中，用 HCI 调 pH 至 7.4,用纯水定容至 1

2、L; (2) EDTA储存液： 18.61 g Na2EDTA 2H20,溶于 70 ml 纯水中，用 10 mol/L NaOH 调节 pH 值至 8.0 (约需2 g NaOH颗粒)，定容为100 ml。可高压灭菌后分装备用； 亮肽素储存液(50/ml，100为 10 mg/ml溶于水，-75 C保存；使用时配成 50用/ml储液，-20 C保存； (4) 抑肽素储存液(70/ml，100为 1 mg/ml溶于甲醇，-75C保存；使用时配成 70冯/ml储液，-20C保存； (5) PMSF 储存液(10 mM, 100 )：x 17.4mg PMSF，溶于1ml异丙醇中，-20 C保存。

3、 (6) DTT 储存液(1 M): 0.31 g DTT溶于2 ml H 2O中，-20 C保存(DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处 理，可过滤除菌)。 (7) 裂解液： Lysis buffer A (9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease in hibitors) Final concen trati on Amount Urea(FW60.06, 9 M Sigma, 99.5%) CHAPS (FW 614.89, 4% (w/v) Sigma, 98% 10.8 g 0.8 g

4、 Ultrapure H2O to 20 ml prepare fresh or store in aliquots at-20C A cocktail of protease in hibitors DTT(FW 154.25, Promega) 1% 13 卩 L/200 卩 L Lysis buffer (15.5 stock),- 20 C Lysis buffer B (7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease in hibitors) Lysis buff

5、er C 40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapureH 2O Lysis buffer D (8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml) Final concen trati on Amount Urea (FW 60.06) 8 M 9.6 g CHAPS 4% (w/v) 0.8 g Tris base (FW 121.1) Ultrapure H2O to 20 ml prepare fresh or store in aliquots at-20C A cocktail of protease in hibi

6、tors DTT(FW154.25, 1% 13 卩 L/200 卩 L Lysis Promega) buffer (15.5 試ock),- 20 C Lysis buffer E (5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease in hibitors) Final cone. Amount Urea 5 M 3.0 g Thiourea(FW 2 M 1.52 g 76.12) SB 3-10 (FW 307.5) 2% 0.2 g CHAPS 2%

7、 0.2 g Ultrapure H 2O to 10 ml Acocktailof protease in hibitors DTT (FW 154.25, 1% 13 卩 L/200 卩 LLysis buffer Promega) (15.5 試ock), -20C Lysis buffer F 100(1LSDS sample solutio n (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT, 25% v/v glycerol) CA、蛋白酶抑制剂混合物和 DTT在临用前加入。 (8)蛋白酶抑制剂混合物3 成分 终浓度 蛋白酶抑制剂混

8、合物 PMSF 35 卩 g/ml or 1 mM EDTA 0.3 mg/ml (1 mM) 抑肽素 0.7 卩 g/ml 亮肽素 0.5 卩 g/ml 1.2方法 1.2.1组织蛋白提取方法 1.3. 121.1三氯醋酸/丙酮沉淀法1 (1) 冰上取材，称湿重，置液氮中冻存或直接进行下一步； (2) 在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织； (3) 将粉末悬浮于含 DTT (0.2% w/v)的10%三氯醋酸(w/v)的丙酮溶液中; (4) 蛋白t20 C沉淀过夜； (5) 35 000 (6 C )离心 30 min ; (6) 将沉淀重悬于含 0.2% DTT的预冷丙酮中； (7)

9、-20 C放置 1 h； (8) 35 000 g (6 C )离心 30 min ； (9) 在通风橱中让丙酮充分挥发，得到干燥的沉淀； (10) 在裂解液中重新溶解沉淀( 50-100 mg 组织需要 1 ml 裂解液)； (11) 15C , 40 000 gX 离心 1hr; (12) 用Bradford法2测定上清的蛋白浓度，分装后置-75C保存。 1.2.1.2 超速离心法 (1) 取材； (2) 用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每1 g样品加入0.5 ml裂解 液，使用组织匀浆器匀浆 30 s； (3) 组织悬液 15C， 10 000 Xg 离心 10 min； (4)

10、上清液 4C， 150 000 Xg 超速离心 45 min； (5) 小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心上清6C 40,000g 再次离心 50 min； 取离心上清。Bradford法定量，分装后置 H5C保存。 1.2.2 培养细胞蛋白提取 1.2.2.1 循环冻融法 (1)吸出培养液弃去，0.01mol/L PBS洗一次； 加入PBS，用橡胶刮收集细胞于10 ml离心管中； (3) 500 g，离心 5 min; 弃上清，PBS洗三次(室温,500为，5 min)， (5) 在离心管中 加入 1ml PBS， 重悬细胞， 用 1 ml 微量加液器移入 Eppe ndorf 管中； (6

11、) 执行Biofuge存储程序8，500为5 min离心； (7) 用200卩微量加液器吸出PBS，弃去； (8) 吸干残留的PBS，估计样品体积，加入 5倍体积裂解液，巴氏滴管混 匀，液氮中反复冻融三次(每次置液氮中3 s,室温融化)，DTT在第一次 冻融后加入； (9) 执行 Biofuge 存储程序 6，15C，40 000 ,离心 1hr (Biofuge)； (10) 上清Bradford法定量，沉淀-75 C保存备用。 1.2.2.2 超声破碎法 (1) 取对数生长期的细胞，吸出培养液弃去， 0.01mol/L PBS 洗一次； 加入PBS,用橡胶刮收集细胞于10 ml离心管中；

12、(3)室温，500 Xg，离心 5 min; 弃上清，PBS洗3次(室温,500 X, 5 min); (5) 在离心管中加入 1ml PBS， 重悬细胞， 用 1 ml 微量加液器移入 Eppendof管中，500Xg离心 5 min ； (6) 吸干残留的PBS，估计样品体积，加入 5倍体积裂解液，混匀，移入 1.5 ml Eppe ndof管中，冰浴中以最大功率超声破碎细胞(3X0 s); (7) 15C, 40 000 gX 离心 1hr (Biofuge); (8) 上清Bradford法定量，沉淀-75 C保存备用。 2 结果和讨论 蛋白质提取的基本步骤包括清洗组织或细胞、裂解细胞

13、、离心除去膜组分等获得溶解 的蛋白质上清。 我们破碎细胞采用循环冻融法和超声波法;破碎组织采用液氮研磨法和机械匀浆法。 循环冻融法操作简便，比较适合提取培养细胞的稳定蛋白，我们后期实验对培养细胞主要 采取这种破碎方式。使用超声破碎必须注意的是控制强度在一定限度，即刚好低于溶液产 生泡沫的水平。因为产生泡沫会导致蛋白质变性，同时要注意散热。匀浆是机体软组织破 碎最常用的方法之一。由于匀浆过程中蛋白质被蛋白酶降解的可能性较小，所以匀浆是简 便、迅速和风险小的组织破碎方法，我们实验室在破碎脑和脊髓组织时常用此法;由于神 经组织比较柔软，液氮研磨法也很适合，本实验中我们使用了这一方法破碎大鼠脊髓组 织

14、，中枢神经组织由于富含脂类，沉淀法和高速离心法可以使蛋白和脂类干扰物质有效分 离，但沉淀法的缺点是再溶解时蛋白损失严重。高速离心的缺点是需要样品量大，如 Beckman L7-65 超速离心机的离心管容量为 8 ml ，不适用小量样品的制备。 在众多的裂解液配方中，我们主要采用9 M 尿素 , 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% 两性电解质加蛋白酶抑制剂混合物，原因是这一配方经长期使用很稳定，裂解效率也 较高，非常适合小量细胞蛋白提取要求。针对富脂的中枢神经组织中脂类物质与蛋白相互 作用，高浓度的尿素可以造成强变性条件 (但如果再提高尿素浓度，尿素就容易析出，影响 蛋

15、白的溶解 )，过量的去污剂也可以减少脂类的污染，两性电解质可以提高蛋白的溶解度， 同时有利于等待聚焦。早期我们加入Tris 碱以防止蛋白的水解，但是由于盐离子的引入， 导致 IEF 电压过低，影响聚焦。 为了防止蛋白的酶解，我们使用了一种广谱的蛋白酶抑制剂混合物，成分见本实验 1.1.4。 第二部分 第一向等电聚焦 (IEF) 等电聚焦( isoelectrofocusing, IEF )是 60 年代建立起来的蛋白质电泳分离技术，无论 是载体两性电解质，还是固相 pH 梯度技术，其基本原理都是利用蛋白质分子或其他两性 分子的等电点的不同，在一个稳定、连续和线性的 pH 梯度中进行分离和分析。

16、 1. 材料与方法 1.1 仪器设备 仪器设备 IPGphor?等电聚焦仪 IPG凝胶条槽 Immobiline DryStrip 3-10L, 3-10NL DryStrip 覆盖液 生产商 Amersham Pharmacia Biotech Amersham Pharmacia Biotech Amersham Pharmacia Biotech Amersham Pharmacia Biotech 1.2试剂 试剂 尿素 CHAPS IPG 缓冲液 DryStrip 覆盖液 DTT Tris 溴酚蓝 甘油 叠氮钠 IPG凝胶条槽清洁液 1.3溶液配制 水合储液(8 M urea, 2%

17、 CHAPS, 0.4% DTT and 0.5 % IPG buffer). 成分 终浓度 用量 尿素(FW60.06) 8 M 12 g CHAPS 2% (w/v) 0.5 g 溴酚蓝 痕量 数粒 用纯水配成25 ml溶液，1 ml分装-0C保存 以下的试剂在临用前加入 IPG buffer 0.5% (v/v) 2.5 卩 l (500 卩l) DTT 0.4% 13 卩 l (500 卩l) SDS平衡缓冲液(50 mM Tris-CI pH 8.8, 6 M尿素，30%甘油，2% SDS,溴酚蓝, 200 ml) 终浓度 用量 1.5 M Tris-Cl, pH 8.850 mM

18、6.7 ml 尿素(FW 60.06) 6 M 72.07 g 甘油(87% v/v) 30% 69 ml SDS (FW 288.38) 2% 4.0 g 溴酚蓝 痕量 数粒 加纯水至200 ml， 10 ml分装-0C保存 1.4方法 (1) 首先清洗凝胶条槽。先用清洗液清洗，再用纯水彻底冲洗，用棉拭子或无纤维纸擦 干凝胶条槽或置于空气中或37 C烤箱中至干，整个过程需戴手套持凝胶条槽以避 免污染(凝胶条槽在使用前必须是完全干燥的)； (2) 用棉球蘸纯水擦拭IPGphor冷却电极板，再用干棉球揩干，检查仪器的电源接触和 水平； (3) 取出-20C保存的再水合液和-75 C保存的蛋白样品

19、，置室温缓慢融化； (4) 用再水合液稀释样品。18 cm胶条终体积350卩,11 cm胶条终体积200卩。此步骤 中需加入 0.4%的DTT和0.5%的IPG buffer; (5) 在开始水合前10 min取出干胶条使在室温中平衡； (6) 把凝胶条槽置于衬有滤纸的水平板上，加入含有样品的再水合液，戴上乳胶手套， 轻轻揭去干胶条上覆盖膜，胶面朝下置槽中，反复提放，前后移动，使胶条与水合 液充分接触，并排除气泡，滴加DryStrip覆盖液覆盖(11 cm凝胶条槽 加1.5 ml, 18 cm凝胶条槽加2 ml)，加塑料盖，用滤纸吸去溢出的覆盖液，置凝胶条槽于 IPGphor电极板上，注意电极

20、接触并用直尺或三角尺调整方向使凝胶条槽与电极方 向平行； (7) 盖下安全盖，开启仪器，检查程序设置，执行。我们在实验中使用的两种程序(18 cm PH3-10L胶条)如下 Table1. The running con diti ons of IPGhor A B Voltage (V) Time (h) Voltage (V) Time (h) Rehydratio n 30V 6:00 Rehydration 30 V 12:00 60V 6:00 200 (step (2) 将250 mg碘乙酰胺溶于10 ml平衡缓冲液中是为平衡缓冲液II ; (3) 将完成聚焦或从-75C取出的凝胶

21、条置加入10 ml平衡缓冲液I的试管中，用封口 膜封住试管口，水平放置在摇床上振摇15 min。打开管口，取出凝胶条用纯水快 速淋洗后置加入10 ml平衡缓冲液I的另一试管中，同样方法振摇15 min ; (4) 两步平衡完成后，用纯水快速淋洗胶面，侧放在提前润湿的滤纸上5-10分钟让多 余的平衡液被滤纸吸收； 1.2.4 SDS-PAGE (1) 设定MultiTemp III恒温循环器的温度为 15C，清洁电极和冷却陶瓷板，检查并调 节仪器水平； (2) 在IPG凝胶条平衡的第一步进行的同时，如SDS凝胶保存在模具中，此时可卸去 夹子，将玻璃板平放，用分样匙铲形端插入支持玻璃板和支持膜之间

22、小心撬动打 开模具； (3) 此时凝胶与带 U形框的玻璃板连在一起，捉住支持膜一角，将带支持膜的凝胶揭 下；在 Multiphorll冷却板上加煤油(小凝胶需1 ml;大凝胶需要 2.5-3.0 ml)， 将凝胶铺在冷却板上，让胶面干燥5-10 min。注：避免凝胶支持膜和冷却板之间 留有气泡，避免煤油污染凝胶表面。 (4) 此时平衡大约进行到第二步，撕开ExcelGel SDS缓冲条的包装，戴上一次性PE 手套小心取出缓冲条。首先将黄色的阳性缓冲条放置在阳极侧(缓冲条长度与基 本一致，约 250 mm)，缓冲条与凝胶表面应完全接触，没有气泡。阳极缓冲条 阳极侧应在 180 mm处；同法将放置

23、阴极缓冲条，其阴极侧应与浓缩胶边缘平 齐，左右两端也要与阳极缓冲调对齐 (5) 此时IPG凝胶条平衡已经完毕，用滤纸吸干胶条背面多余的水分，将胶面朝下将 胶条放置距阴极胶条2-3 mm处(注意胶面接触处不可有气泡)，酸性端距 SDS 凝胶右侧边缘30 mm，碱性端距左侧边缘 40 mm。 (6) 将两张IEF上样滤纸片插入IPG胶酸碱性末端支持膜形成的间隙中，滤纸片应垂 直IPG凝胶条垂直，与 SDS凝胶表面接触良好，分别以一侧与IPG凝胶的酸碱性 末端充分接触。 (7) 将剪去一半的IEF上样滤纸片放在距胶条碱性端10 mm处，加入10 d SDS标准 蛋白 (8) 预置带电极的玻璃板，调整

24、正负电极位置分别在相应缓冲条的正下方，放置电极 使与缓冲条接触。 (9) 盖上安全盖，打开电源，检查程序设置，执行第一步。当第一步完成时，溴酚蓝 前沿一般离开IPG凝胶条8-10 mm。此时移去IPG凝胶条和所有的上样滤纸片， 将阴极缓冲条前移至正好覆盖原IPG凝胶条所在处，然后开始第二步电泳，在溴 酚蓝前沿抵达阳极缓冲条时再电泳 10-20分钟结束。 Table 3. Running con ditio ns of laboratory-made SDS homoge nuous gels (13% T, 3% C) Small size SDS gel (250110 XK5 mm) Vo

25、ltage (V) Curre nt(mA) Power (W) Time (h) Step1 100 20 30 0:20 Step2 400 30 30 2:00 Large size SDS gel (250180 .5 mm) Voltage (V) Curre nt(mA) Power (W) Time (h) Step1 150 20 30 0:30 Step2 600 30 30 3:00 1.2.5染色 我们的染色是在自动染色仪上进行，溶液配制完成后，染胶工作完全自动 Table 4. Silver stai ning StepSolutionStep In Out Statu

26、s Tim e (min ) Fixing etha nol 400 ml (40%)1 1 7 hold 60 acetic acid 100 ml(10%) beep add pure water up to rock Incubation 75ml etha nol 30 17g Na-acetate Na2S2O3 5H2O 0.5g or 0.4 g add pure water to 250ml or 200 ml Washingpure water 3-507 Silvering AgNO 30.5 g or 0.4 g 6 5 3 20 add pure water to 25

27、0ml or 200 ml Washing pure water 7-8 07 beep 1 Development 6.25g Na2CO3 9 48 hold 6 Formaldehyed rock -10 100 u lor 80 u l (1/10000) beep add pure water to 250ml or 200 ml Stopping 100 ml acetic acid add 10 10 1000 ml pure water to 250ml or 200 ml Washing pure water 11 13 07 5 3 Preserving 87ml glyc

28、erol 14 67 hold 30 add pure water to 250ml or 200 ml 注： *add Na-acetate first, then ethanol.; 2.结果和讨论 2.1 SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制 在我们建立方法的早期，我们最先开始的就是灌制SDS聚丙烯酰胺凝胶，因为双向分 离最终体现在第二向上，尽管有商品的预制胶但价格昂贵，每张18CM的预制胶市场价格 可达60美圆。但实验室自制凝胶只需要简单的设备，使实验成本大大降低，我们的重复性 实验使用自制的聚丙烯酰胺凝胶，仍旧得到很高的重复匹配率。 第二向APB公司推荐两种规格的小孔梯度SDS凝胶，Excel

29、Gel 8-18和ExcelGel XL SDS 12-14,我们在实验早期灌制的就是小孔梯度胶。这是最早的小孔梯度胶配方11。 Table 5 . Recipes for the preparati on of pore gradie nt gel (8-18%T) (C=3%, T=4%) Resolvi ng gel (C=3%, T=818%) Dense Soluti on Light Solution Acrylamide/Bis 0.65 2.7 6 Gel Buffer 1.25 - - Gel Buffer - 2.5 2.5 87% Glycerol 1.4 2.8 - U

30、ltrapure H2O (mL) 1.7 2.0 1.5 Final volume (mL) 4/16 9/36 9/36 TEMED (卩 L) 5 10 10 40% APS (卩 L) 3 5 5 我们在使用这一配方遇到的问题是，聚合后的凝胶在浓缩胶和分离胶接触的两侧出现 弧线，开始认为原因是未预冷模具，导致浓缩胶过快聚合，最后与其他配方比较表明表明 是浓缩胶的甘油浓度不够 (24.4%)，导致浓缩胶液面在分离胶液体因重力作用的冲击形成弧 形后没有足够的张力恢复到水平状态，因此我们提高了浓缩胶甘油含量。正当我们打算使 用小孔梯度凝胶做第二向时，2000年11月APB公司在北京组织了一次

31、双向电泳的讨论 会，期间Dr. Reiner Westermeier向我们推荐使用 SDS均一凝胶作第二向，同时指出使用小 孔梯度凝胶，蛋白点过于集中阴极侧和中间，这和我们遇到的问题是一样的，这可能就是 由于小孔梯度凝胶过强的分子筛效应造成的。后来我们改成均一凝胶。 根据样品的不同，可以调整 T值，大鼠脊髓组织样品 T=10%蛋白点分布较均匀，但一 些小分子蛋白距前沿过近容易损失，我们一般采用T=12.5%和T=13%，这样的总百分浓度 也适合于绝大多数的组织细胞样品。均一胶的配方在小孔梯度胶的基础上改进： a) 增加了浓缩胶甘油浓度，确定分离胶甘油浓度； b) 调整APS和TEMED的量；

32、c) 将浓缩胶T值升至6，增加浓缩胶的分子筛效应； d) 灌制完成后分离胶上覆盖纯水，避免了外界空气对聚合的影响，同时消除了分离 胶上聚合后出现的波浪状不平整现象。 使用改进后的配方灌制的SDS均一凝胶浓缩胶与分离胶分界平直，分离效果好，后期 染色背景浅，蛋白点锐利。 2.2 IPG凝胶条的平衡 平衡的目的是用 SDS和DTT覆盖和去除多肽的折叠，为第二向作准备，甘油和尿素 的使用可以减小电内渗效应，多余的DTT被碘乙酰胺除去以阻止点的脱尾。 离液剂已知减弱 SDS和蛋白的相互作用，可能是当存在于平衡液时，干扰蛋白与SDS 结合的饱和度。 尿素-硫脲溶液是很有效的变性剂，但是在平衡时离液剂会削

33、弱SDS和蛋白的相互作 用12，特别是硫脲，所以硫脲的浓度不能超过2M 两步平衡时是造成蛋白损失的主要原因，大约7-10%的蛋白蛋白在此过程 中损失，其中第一步的损失更大，凝胶条中的载体两性电解质可以有助于减少 蛋白的损失。 DTT GLVCE1QL I * -* 舌 THIHCL pH 6.KIODOflErflM(Df Figure 4. Equilibratio n 2.3硝酸银染色 在染色方面，考马斯亮蓝和硝酸银染色比较常见，后者的灵敏度比前者高50倍，但步骤较 多，主要用于分析，而前者主要用于微制备，银染的强度存在不稳定的问题13，最近有 人提出荧光染色可以解决这一问题 14 第四部

34、分质谱鉴定 1. 材料与方法 1.1材料 银染脱色储存液A: 100 mM硫代硫酸钠 银染脱色储存液 B: 30 mM铁氰化钾 10 ng/d胰蛋白酶 50 mM碳酸氢铵 肽片断抽提液：5%三氟乙酸（TFA） , 50%乙腈（CAN ） 2.方法 2.1脱色 2.1. 1考马斯兰染脱色 用解剖刀片沿染色边缘切下选定的蛋白点，用含50%乙腈，25mM碳酸氢氨的溶液 100川浸泡胶片，涡旋混合器振荡20min，弃去溶液，重复 1-2遍至胶片中的蓝色褪尽。胶 片真空离心干燥。 2.1.2银染脱色 储存液A: 100 mM硫代硫酸钠，储存液 B: 30 mM铁氰化钾 工作液：使用前1:1混合储存液A:

35、B 1. 按50 d蛋白点加入工作液，振摇； 2. 脱色至棕色消失，用纯水漂洗数次终止反应； 3. 加入100卩l 200mM碳酸氢铵，20 min后吸弃溶液； 4. 纯水漂洗数次终止反应，反复加入乙腈脱水至白色； 5. 凝胶真空干燥30 min。 2.2胶内胰蛋白酶消化 a）加入5-8 d适量5-10ng/卩胰蛋白酶和50mM碳酸氢铵，37C孵育过夜； b）10-20 d lof 5%三氟乙酸 50%乙腈溶液抽提肽片断，将抽提液真空干燥浓缩至 5 d l 50- 4- c）（可选）使用美国Millipore公司的10 d IZipTiC18移液器吸嘴脱盐。操作如下 先用50%的乙腈湿润吸嘴，然后用 0.1%的TFA水溶液平衡两次，将萃取后冻干 的样品用20卩IO.1%TFA水溶液溶解，用吸嘴反复在样品液中吸进压出，进行多次 循环操作，然后用 0.1%TFA水溶液洗涤两次，另取一干净的小EP管吸入 5卩ICCA饱和基质溶液（用50%CAN 0.1%TFA=1:1配制），再将带有样品的吸嘴在 其中反复洗脱，取2 点于不锈钢点样板上，置空气中自然风干。？ 胰酶用25mM碳酸氢氨溶液配成 0.05-0.01川的溶液，分别加入样品5-8川，37