酶联免疫吸附试验ELISA手工操作必知要点

1、酶联免疫吸附试验（ELISA） 手工操作注意事项 酶联免疫吸附试验ELISA手工操作必 知要点 酶免疫测定类型 这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为 酶联免疫吸附剂测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA。 酶免疫技术酶免疫技术 酶免疫组化酶免疫组化 酶免疫测定酶免疫测定 均相酶免疫测定均相酶免疫测定 非均相酶免疫测定非均相酶免疫测定 固相酶免疫测定固相酶免疫测定 液相酶免疫测定液相酶免疫测定 酶联免疫吸附试验ELISA手工操作必 知要点 ELISA原理（以一步法双抗体夹心法测抗原为例） ELISA其原理为抗原抗体特异性结合和抗原抗

2、体的酶标记，以酶 催化底物显色来判断结果。 酶联免疫吸附试验ELISA手工操作必 知要点 影响酶联免疫测定的因素较多, 诸如标本的采集 保存、试剂的准备、加样的技术、孵育温度的控 制、洗涤反应板的方式、显色反应时间的控制等 一系列问题均有可能对试验结果产生很大的影响, 只有避免了这些因素, 才能保证试验结果的准确 性和可靠性。 酶联免疫吸附试验ELISA手工操作必 知要点 一、移液枪的使用一、移液枪的使用 酶联免疫吸附试验ELISA手工操作必 知要点 1. 样品准备 （1） 吸样之前要保证移液枪、枪头和液体 处于相同温度。置于冰箱保存的样品应提 前取出，室温放置，使温度平衡后再吸样。 液体温度

3、 吸头温度的 移取的液体体积 会 偏大 液体温度 吸头温度的 移取的液体体积 会 偏小 （2） 若溶剂瓶中液体太少，可倒入EP管中， 方便吸取。 酶联免疫吸附试验ELISA手工操作必 知要点 2. 体积设定 大体积 小体积 逆时针 精度最佳 小体积 大体积 顺时针 调至超过设定刻度，再回调 可保证最佳的精确度 严格的精确调节方法 酶联免疫吸附试验ELISA手工操作必 知要点 3. 装枪头 将移液枪端垂直插入吸头，左右微微转动，上紧即可 上下敲击会引起内部 的零部件因瞬间强烈 撞击而松散， 甚至会导致调节刻度 的旋钮卡住 酶联免疫吸附试验ELISA手工操作必 知要点 4. 吸液 （1） 垂直吸液

4、，枪头吸嘴尖端需浸入液 面2-4mm以下。 （2） 枪头吸嘴预润湿（2-3次），使吸 嘴内壁液体吸附达到饱和，再吸入样液， 最后打出液体的体积会很精确。 一般液体，正向吸液（一档二档）。 粘稠液体和易挥发液体，可反相吸液（二档一档）。 正向吸液反向吸液 酶联免疫吸附试验ELISA手工操作必 知要点 （3） 缓慢吸取，控制好弹簧的伸缩 速度。吸液速度太快会产生反冲和气 泡，导致移液体积不准确和腐蚀枪体。 （4） 吸取后将移液枪提离液面，停 约一秒钟，观察是否有液滴缓慢地流 出。若有流出，说明有漏气现象（原 因有：枪头未上紧；枪头不匹配；移 液枪内部气密性不好）。 （5） 吸嘴外壁残留液滴可沿壁靠

5、去 或用滤纸蘸擦。 酶联免疫吸附试验ELISA手工操作必 知要点 5. 放液 （1） 将吸嘴口贴到容器内壁并保持10- 40倾斜。 （2） 平稳地把按钮压到一档，停约一 秒钟二档，排出剩余液体。排放致密 或粘稠液体时，压到一档后，再多等一 两秒钟二档。 （3） 压住按钮，同时提起移液器，使 吸嘴贴容器壁擦过。 （4） 松开按钮。 （5） 按弹射器除去移液嘴。 （6） 使用完毕。 酶联免疫吸附试验ELISA手工操作必 知要点 移液枪的养护及注意事项 吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指， 绝不允许突然松开，以防溶液吸入过快而 冲入枪体内腐蚀柱塞造成漏气。 移液枪应轻拿轻放，不能将已吸有液体的 移液

6、枪平放或倒置，以免液体倒流腐蚀活 塞弹簧。 不得用移液枪移取有腐蚀性的溶液，如强 酸、强碱等。 如有液体进入枪体，应及时擦干。 千万不要将按钮旋出量程，否则会卡住内 部机械装置而损坏移液枪。 移液枪长时间不用时建议将刻度调至最大 量程，让弹簧恢复原形，保持松弛状态， 延长移液枪的使用寿命。 应定期对移液枪进行校准。 酶联免疫吸附试验ELISA手工操作必 知要点 二、二、ELISA具体操作具体操作 1 标本的收集和保存 2 试剂的准备 3 加样本及反应试剂 4 温育 5 洗板 6 显色 7 比色 8 结果判断 酶联免疫吸附试验ELISA手工操作必 知要点 1 标本的收集和保存 未抗凝血标本离心前

7、一般令其自行凝集， 不可用木棍等剥离凝血块。通常于室温 （2025）放置3060min，血标本可 自发完全凝集，析出血清；或37水浴 2030min，析出血清。 以3000r/min转速离心510min，使血清 分离完全。 若过早离心，分离不全，血清中会残留部 分纤维蛋白原，吸附于反应微孔，并且不 易洗去，可与酶标记物非特异性结合，造 成假阳性。 酶联免疫吸附试验ELISA手工操作必 知要点 1 标本的收集和保存 （1）要注意避免出现严重溶血、脂血标 本。 血红蛋白中铁卟啉具有类似过氧化物酶 的活性，因此，在以辣根过氧化物酶 （HRP）为标记酶的ELISA测定中，如 标本溶血，血清中血红蛋白浓

8、度较高， 则其很容易在温育过程中吸附于固相， 从而与后面加入的底物反应，从而产生 非特异性显色。 脂血标本血清中大量的脂质小粒易黏附 于反应孔内壁，非离子型洗涤剂(如乳化 剂OP)难以洗去，易产生非特异性吸附干 扰。 酶联免疫吸附试验ELISA手工操作必 知要点 1 标本的收集和保存 （2）血清标本宜在新鲜时检测，要注意 尽量避免细菌污染。 血清标本如在冰箱中保存过久，IgG可发 生聚合，AFP可形成二聚体，使本底加 深，产生假阳性反应。 细菌生长所分泌的一些酶可能会对抗原 抗体等蛋白产生分解作用；一些细菌的 内源性酶可对以相应酶作标记的测定方 法产生非特异性干扰。标本在保存中如 出现细菌污染

9、所致的混浊或絮状物时， 应离心沉淀后取上清检测。 酶联免疫吸附试验ELISA手工操作必 知要点 1 标本的收集和保存 （3）冰冻保存的标本须注意避免因停电 等造成的反复冻融。 标本的反复冻融所产生的机械剪切力将 对标本中的蛋白等分子产生破坏作用， 从而引起假阴性结果。此外，冻结样本 溶解后，蛋白质局部浓缩、分布不均， 应上下颠倒轻缓混匀，避免气泡，不要 在混匀器上强烈振荡。 反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗 体的血清标本如需保存作多次检测，宜 少量分装冰冻保存。 酶联免疫吸附试验ELISA手工操作必 知要点 2 试剂的准备 试剂盒成分： 常用的固相载体（ELISA板孔）材质： 聚苯乙烯、聚氯

10、乙烯，具有良好的吸附 性能，孔底透明度高，空白值底，各板 之间、同一板各孔之间性能相近。包被 抗原或抗体与聚苯乙烯固相载体通过疏 水基团作用物理吸附结合。 常用的酶：HRP，AP，葡萄糖氧化酶， -D-半乳糖苷酶和脲酶等。 洗液：非离子型洗涤剂 酶反应的底物： H2O2，为受氢体； 显色剂：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺 (TMB)和ABTS，为供氢体。 终止液为硫酸。 酶联免疫吸附试验ELISA手工操作必 知要点 2 试剂的准备 （1）在实验开始前，将试剂盒先从冰 箱中取出，在室温下放置30分钟以上， 再进行测定，以使试剂盒在使用前与室 温平衡。这样做的目的，主要是为了缩 短升温时间，使反

11、应孔内的温度能较快 地达到所要求的高度，以满足测定要求。 （2）试剂盒中的洗涤液如需在使用时 对所提供的浓缩液稀释配制，稀释时所 用的蒸馏水或去离子水应保证质量。 酶联免疫吸附试验ELISA手工操作必 知要点 3 加样本及反应试剂 在ELISA实验中一般有3次加样步骤，即 加标本、加酶结合物、加底物和显色剂。 加样必须注意的关键点是： （1）加样不可太快，要避免加在孔壁上 部，不可溅出和产生气泡。加样时如有 气泡，抗原抗体不能有效地结合会导致 弱阳性甚至假阴性。 （2）每次加标本应更换吸头，以免发生 交叉污染。有些测定需用稀释的血清， 应保证稀释液与血清混合均匀。 （3）加酶结合物、加底物，应

12、使加液量 准确均一、加液过程迅速完成。也可使 用试剂盒提供的滴瓶直接滴加。滴加时， 除了要注意滴加的角度垂直、一致外， 滴加的速度也很重要。滴加太快，很容 易出现重复滴加或加在两孔之间的现象。 酶联免疫吸附试验ELISA手工操作必 知要点 4 温育 温育是ELISA测定中影响测定成败最为 关键的一个因素。 ELISA属于固相免疫测定，要使液相中 的抗原或抗体与固相上的特异性抗体或 抗原完全结合，必须在一定温度条件下 反应一定的时间。一般温育所需时间与 温度成反比，即温度越高，所需时间相 对较短。最为常用的温度有37和室温 (2025)，其次是43和28，目 前国内ELISA商品试剂盒的反应温育

13、时 间通常为373060分钟。 关于温育，在实际测定操作中一定要注 意以下几点： 酶联免疫吸附试验ELISA手工操作必 知要点 （1）要保证在设定的温度下有足够的反 应时间。 一般来说，加完样本或反应试剂后，将 微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时， 孔内温度从室温升至37，需要一定的 时间，尤其是在以及 下，这段升温时间可能还比较长， 而在临床实验中，很少有人注意这个问 题，通常是将微孔板一放入温箱即开始 计时，这样就很容易造成在实际测定中 温育时间不够，弱阳性样本测不出来的 问题。 为保证37下足够的温育时间，实验室 水浴状态应保证微孔，使 温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应贴 片或封盖。 板底

14、贴着水面 酶联免疫吸附试验ELISA手工操作必 知要点 （2）温育温度的选择。 在有的ELISA试剂盒的说明书中，指出 温育温度可有两种，例如，一种是37 下1小时，另一种则为43下45分钟。 从免疫测定抗原抗体反应的本质来看， 在较低的温度下反应较长的时间最为完 全，产物最稳定。如28下反应24小 时。较高的反应温度，由于分子运动的 加快，反应时间缩短，这一点对分子含 量较多的强阳性样本测定没有问题，但 对分子含量少的弱阳性样本则有漏检的 可能。因此，如须选择反应条件，建议 在临床ELISA测定中尽量使用较低温度 较长反应时间的条件。 酶联免疫吸附试验ELISA手工操作必 知要点 （3）“边

15、缘效应”的排除。 以前在使用96孔板的ELISA测定中，常 发现有“边缘效应”，即外周孔显色较 中心孔深。聚苯乙烯本身为不良热导体， 在实验室的常规ELISA测定中，将板从 室温置于37温箱(非水浴)，板孔升温时， 在外周孔与中心孔之间可能存在一热力 学梯度。因此反应板不宜叠放，以保证 各板的温度都能迅速平衡。 而将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底 应贴着水面，可使温度迅速平衡。让反 应板飘浮在水面上。就可以很容易地排 除“边缘效应”，并且可提高测定的重 复性。 酶联免疫吸附试验ELISA手工操作必 知要点 5 洗板 洗涤在ELISA虽不是一个反应步骤，但 也决定着实验的成败。ELIS

16、A就是靠洗 涤清除残留在板孔中没能与固相抗体 （抗原）结合的物质，以及在反应过程 中非特异性的吸附于固相载体的干扰物 质，以保证ELISA测定的特异性。 洗涤液为非离子型洗涤剂的中性缓冲液。 聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性 的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也 含亲水基团，使蛋白质回复到水溶液状 态，从而脱离固相载体。 在实验室中，ELISA测定的洗板一般有 两种方式，即手工和洗板机洗板。为保 证微孔板的均一性使结果准确可靠，最 好选用洗板机洗板。若手工洗板，要注 意浸泡时间和孔间洗液最好不要互相流 动。流水冲洗法让水流冲击板孔表面， 简便、快速，洗涤效果较好。 酶联免疫吸附试验ELISA手

17、工操作必 知要点 6 显色 在以HRP作为标记酶的ELISA试剂盒中， 一般显色反应条件为37或室温反应15 30分钟。在一定时间内，阴性孔可保 持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色 加强。TMB （四甲基联苯胺）经HRP作 用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐 减弱，至2小时后可完全消退至无色。 TMB的终止液有多种，酸性终止液（硫 酸）会使蓝色转变成黄色，此时可用特定 的波长（450nm）测读吸光值。 酶联免疫吸附试验ELISA手工操作必 知要点 7 比色 ELISA的比色测定由酶标仪进行。此处 强调以下几点： （1）酶标仪不应安置在阳光或强光照射 下，室温宜在1530， ，测读结果更稳定

18、。各 种酶标仪性能不同，使用前应详细阅读 说明书。 （2）比色前应先用洁净的吸水纸 ，然后将板正确放入比色 架中，以免锈蚀酶标仪比色架。 （3）比色测定时，一定要注意酶标仪的 波长是否已调至合适或所用滤光片是否 正确。 酶联免疫吸附试验ELISA手工操作必 知要点 （4）单波长或双波长比色选择的问题。 所谓的单波长比色即是通常的以对显色 具有最大吸收的波长如450nm或492nm 进行比色测定； 而双波长比色则在敏感波长如450nm和 非敏感波长如630nm下各测定一次，最 后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸 光度值与非敏感波长下的吸光度值的差 值。 因此，双波长比色测定具有能排除由微 孔板本身、板孔内标本的非特异性吸收、 指纹、刮痕、灰尘等对特异显色干扰的 优点。 酶联免疫吸附试验ELISA手工操作必 知要点 8 结果判断 临床ELISA测定按其表示测定结果的方 式分为定性和定量测定两大类。 定性测定只是对标本中是否含有待测抗 原或抗体作出“有”或“无”的结论， 分别用“阳性”和“阴性”来表示；定 量测定，每批测试均须用一系列不同浓 度的标准品在相同的条件下制