FISH杂交技术[行业一类]

1、 1讲课材料 原位杂交（ISH） 原位杂交 (in situ hybridization, ISH) 将标记 的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交。 使用DNA或者RNA探针来检测与其互补的另 一条链在细菌或其他真核细胞中的位置。 原位杂交技术(ISH)是分子生物学、组织化学 及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于 20世纪60年代。 2讲课材料 基本原理 根据碱基互补配对原则，同源的DNA-DNA、 DNA-RNA和RNA-RNA两条单链在一定条件下 能结合成双链。用放射性或非放射性物质标记 的DNA、RNA或与mRNA互补的cDNA作探针 ，与组织切片或细胞内待测核酸(RNA或DNA)

2、 片段进行杂交，经放射自显影或非放射检测体 系予以显示，在组织、细胞、间期核及染色体 上对核酸进行定位和相对定量研究。 3讲课材料 原位杂交常用的标记物质 3H、35S、125I、32P等 2 荧光素、生物素、地高辛等 放射性同位素 1 非放射性物质2 70年代 80年代中后期 4讲课材料 几种原位杂交技术 1 基因组原位杂交技术 2 荧光原位杂交技术 3 多彩色荧光原位杂交技术 4 原位PCR 5讲课材料 荧光原位杂交 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization， FISH）是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的 基础上发展起来的一种非放射性分子

3、细胞遗传技术,它 提供了将特定DNA片段和特定的真核生物细胞的染色体 区带联系起来的快速而有效的手段,是研究DNA序列在 染色体上位置的最直接的方法,自问世以来就广泛应用 于生物学研究中。它是以荧光标记取代同位素标记而形 成的一种新的原位杂交方法，探针首先与某种介导分子 (reporter molecule)结合,杂交后再通过免疫细胞化学过 程连接上荧光染料。 6讲课材料 FISH发展 1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的 DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA 获得成功之后,Pardue等同年又以小鼠卫星DNA为模 板,利用体外合成的含3H的RNA为探针成功地与

4、中期 染色体标本进行了原位杂交,从而开创了RNA-DNA的 同位素原位杂交技术。他们都是采用放射性同位素标 记探针,需要采用放射自显影进行检测,这种检测上的 限制及当时分子克隆方法的缺乏使得DNA原位杂交 技术不能很快得到广泛应用。 7讲课材料 FISH发展 1974 年，Evans第一次将染色体显带技术和原位杂交技术结合 起来,提高了基因定位的准确性。 1975 年,Manning 等最先在溶液的分子杂交中,使用非放射性标记 ,通过细胞色素C 将生物素与RNA 分子连接起来。 1977 年Rudkin发明了用间接免疫荧光法检测目的DNA 的非同位 素原位杂交(NISH)。 1981 年，La

5、nger 等首次采用生物素标记的核苷酸探针成功地进 行了染色体原位杂交,建立了非放射性原位杂交技术。至此,以荧 光标记的探针在细胞制片上进行基因原位杂交的技术建立起来。 1985 年，荧光原位杂交技术被引进到植物。 1986 年，Cremer 与Licher 等分别证实了荧光原位杂交技术应用 于间期核检测染色体非整倍体的可行性,从而开辟了间期细胞遗 传学研究。 8讲课材料 20世纪90年代， 随着人类基因组计划 的进行，由于绘制高 分辨人类基因组图谱 的需要，FISH技术得 到了迅速的发展和广 泛应用。 FISH发展 9讲课材料 FISH原理 FISH是以荧光素直接标记的已知核酸分子 为探针，

6、探针和靶序列双链DNA变性后杂交 ，互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和 离子强度下退火形成稳定的异源待检的杂交 体双链DNA，通过荧光标记显示出来，通过 荧光显微镜观察杂交信号。 10讲课材料 11讲课材料 荧光原位杂交特点 1.FISH不需要放射性同位素作探针标记,安全性高； 2.FISH探针稳定，一次标记后可在两年内使用，经济、安 全； 3.实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确； 4.FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性 探针相当； 5.多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测 多种序列； 6.既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化,也可

7、 以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。 12讲课材料 FISH不需要放射性同位素作探针标记,安全性高; FISH的实验周期短,探针稳定性高; FISH能通过多次免疫化学反应,使其杂交信号明显增强,从而 提高灵敏度,检测的灵敏度接近同位素探针杂交； FISH的分辨率高达320Mb； FISH可以用不同修饰核苷酸分子标记不同的DNA探针,再用 不同的荧光素分子检测不同的探针分子,因此可以在荧光显微 镜下在同一张切片上同时观察几种DNA探针的定位,直接得到 它们的相关位置和顺序,从而大大加速生物基因组和功能基因 定位的研究。 13讲课材料 14讲课材料 实验流程 FISH样本的样本的制备制备 探针

8、的探针的制备制备 探针标记探针标记 杂杂 交交 （染色体显带）（染色体显带） 荧光显微镜检测荧光显微镜检测 结果分析结果分析 15讲课材料 植物染色体常规制片 实验材料 蚕豆根尖 实验目的 制备出分裂相多、杂质少、背景清晰、染色体 分散且形态好的染色体标本 实验步骤 取材 预处理 固定 解离（酸解） 染色 压片 镜检 16讲课材料 染色体制片 固定 固定液处理 对保持染色体完好形态很重要，并能使染色 体核蛋白保持原有结构，使染色体更接近活体状态。 解离 酸解或酶解 若解离时间不足，细胞壁不能完全消化，染 色体便无法分散、铺展; 若解离时间过长，则可能导致染色体 离散丢失。 染色 解离后材料彻底

9、水洗并吸干，取根尖2-3mm分生组织于载 玻片上夹碎捣烂，滴加12滴染液，染色510min。 压片 染色后的材料上加一些染液，盖上盖玻片，再用钝头的 用具敲打，使材料分散压平，最后，覆一层吸水纸，以拇指垂 直紧压盖片(注意勿使盖玻片移动)，便于观察。 镜检 先在低倍镜下寻找有分裂相的视野，再用高倍镜仔细观 察、记数。找出染色体分散较好的中、后期细胞进行染色体计 数,并准确记录其位置。17讲课材料 间期 在光学显微镜下 ，只看到均匀一致 的细胞核及许多的 丝状染色质。实质 上间期的核是处于 高度活跃的生理生 化的代谢阶段，正 为细胞分裂准备条 件。 18讲课材料 前期 核内染色质逐渐 浓缩为细长

10、而卷曲 的染色体，每一染 色体含有两个染色 单体，它们具有一 个共同的着丝点； 核仁和核膜逐渐模 糊不明显。 19讲课材料 中期中期 核仁、核膜逐 渐消失，各染色 体排列在赤道板 上，纺锤丝与染 色体的着丝点相 连。染色体分散 ，易于鉴定形态 、数目。 20讲课材料 后期后期 各染色体着丝点分 裂为二，其每条染色 单体也相应地分开， 并各自随着纺锤丝的 收缩而移向两极，每 极有一组染色体，数 目和原来的相同。 21讲课材料 末期 分开在两极的染 色体各自组成新的细 胞核，在细胞质中央 赤道板处形成新的细 胞壁，使细胞分裂为 二，形成两个子细胞 。这时细胞进入分裂 间期。 22讲课材料 23讲课

11、材料 24讲课材料 25讲课材料 26讲课材料 27讲课材料 28讲课材料 小 麦 染 色 体 制 片 29讲课材料 探针制备 所谓核酸探针即是指一段用放射性核素或其他标记物(如酶 与荧光素等)标记的与目的基因互补的DNA片段或单链DNA或 RNA。根据其来源可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸 探针、RNA探针以及PNA探针。 1. cDNA探针 以mRNA为模板在逆转录酶的催化下合成 一条与mRNA互补的DNA链(cDNA)用碱除去mRNA 2.基因组探针 是把染色体DNA通过超声击断或以限制性内 切酶不完全水解获得许多染色体DNA随机片段择长度 约15-20kb的DNA片段重组到噬菌

12、体中经体外包装转染 大肠杆菌筛选出含目的基因的大肠杆菌扩增后提取质 粒 酶切分离目的基因。 30讲课材料 3.寡核苷酸探针 为人工合成的DNA片段，一般长约20- 50个bp（碱基）。可根据已知DNA或RNA序列合成精确 互补的DNA探针；如不知核酸序列，可依据其蛋白产物的 氨基酸顺序推导出核酸序列合成DNA探针。DNA自动合 成仪的出现使探针的合成十分方便。由于分子小，因此更 容易渗透到细胞的目标区域；但也正由于分子小，限制了 其所能携带的荧光基团或报告分子数目，并最终导致杂交 后荧光信号较弱。因此这类探针仅实用于对重复单位较短 的高度重复序列的荧光原位杂交分析。 探针制备 31讲课材料 4

13、.RNA探针 制备的技术路线为：将一段含完整或部分 基因的DNA片段插入重组质粒的多克隆位点，以内切酶在 插入片段中某一适当部位或在插入片段下游的某一部位消 化重组质粒，使之成为线性DNA，在相应的DNA依赖性 RNA聚合酶催化下，以含目的基因的DNA片段为模板合成 RNA探针。由于RNA探针为单链，杂交时不存在第二条链 的竞争，所以其敏感性较经缺口平移标记的DNA探针要高 。 RNA-RNA杂交分子在所有可能的杂交分子中最稳定， 但RNA探针容易被RNase降解。 探针制备 32讲课材料 5.肽核苷酸（PNA）探针 PNA寡聚物是一类新分子，其结构与 DNA相似。但在PNA中，没有核糖-磷

14、酸基骨架，其骨架是不带电的肽链(聚酰 胺)。与DNA相比，PNA对热稳定、与 DNA的结合不依赖于离子强度，因此杂 交时，受探针变性温度和溶液PH的影响 较小，鉴于这些特点和优点，PNA有望 取代DNA或RNA作为FISH的探针。但 由于PNA探针只能通过化学方法进行合 成，而且合成费用高，因此迄今所用的 PNA探针还仅限于染色体的泛着丝粒和 泛端粒探针。 探针制备 33讲课材料 PNA与DNA杂交时也遵循碱基互补配对原则 34讲课材料 探针设计与特异性 探针是FISH检测灵敏度和准确性的关键。 FISH检测的准确性来源于探针的设计。FISH 能否应用于某一领域也取决于是否具有相应的 探针。用

15、于FISH检测的探针必须具备很高的 特异性，能特异性地识别特定的基因或染色体 上特定的片断。而且FISH的探针必须能经受 原位杂交的处理而不变性。荧光基团的标记也 直接影响了检测的灵敏度和原位杂交结果的检 测方式。 35讲课材料 以著名的探针生产商Vysis公司的LSI系列探针为例： LSI系列探针来源于BAC大片断基因组文库，探针所覆 盖的染色体片断总长可达100Kb400Kb，保证了探针 的高特异性和极强的荧光信号；荧光基团采用直接标记 法标记，不同波长的荧光基团使探针在荧光显微镜下呈 现多种荧光信号，借此我们可以一次检测多个染色体或 基因的异常；由于探针具有极强的荧光信号因而对FISH

16、结果的检测也采用直接检测法，即在荧光显微镜下直接 观察FISH的信号，而无需抗原抗体反应对荧光信号进 行放大。Vysis探针的设计既确保了探针的特异性和灵敏 度，同时直接的镜检也使FISH检测更简便。 探针设计 36讲课材料 探针设计 37讲课材料 探针类型 1、染色体单一序列探针，包括各类人工染色体探针，如酵 母人工染色体、细菌人工染色体，主要用以识别染色体的 易位、缺失和扩增。 探针标记2、染色体涂染探针，包括通过流式分选或显微切 割获得的全染色体或染色体臂以及特异性区带的涂染探针 ，用以检测染色体数目或结构异常。 3、染色体重复序列探针，主要是指着丝粒-卫星 DNA 重 复序列探针和端粒

17、重复序列探针，用以检测染色体数目异 常。 38讲课材料 39讲课材料 染色体涂染探针：判断易位染色体 40讲课材料 41讲课材料 探针标记 为了确定探针是否与相应的基因组 DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便 在结合部位获得可识别的信号。 42讲课材料 探针标记 v 放射性标记：很难满足灵敏度和分辨率这两个原位杂交成功 的条件，灵敏度要求放射性标记具有高中辐射能（32P），当标记 物能量过高时，会因为信号散射导致分辨率过低；如果使用低辐 射能的放射性标记物（3H）可以得到较高分辨率，但由于灵敏度 低而需要长时间曝光，并由此导致背景过高而难以分辨出真正信 号。 v 非放射性标记：常用的有生物素

18、与荧光素。生物素一般通过 连接到dUTP等核苷三磷酸上，这种经修饰的核苷三磷酸再通过 酶促反应掺入到探针中；荧光素核苷三磷酸可在DNA聚合酶作用 下掺入到探针中去，常用的荧光素有异硫氰酸荧光素（FITC）、 羧基荧光素（FAM）、四氯-6-羧基荧光素(TET)、吲哚二羧氰（ Cy3，Cy5）等 43讲课材料 标记探针的物质 标记探针的物质： （1）生物素(biotin)/地高辛(digoxigenin) 半抗原报告分子（间接标记） 间接标记：是采用生物素标记DNA探针，杂交后再 用联有荧光素的抗生物素抗体检测。（可将检测信号 放大，监测到小至500bp的靶序列） （2）荧光物质（直接标记） 直

19、接标记：是通过荧光素直接与探针核苷酸或磷酸 戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时掺入 荧光素核苷三磷酸标记探针。（检测步骤简单，但不 能将信号放大，不如间接标记的探针灵敏） 44讲课材料 探针标记 探针标记可以采用均匀标记和末端标记 的方法。 均匀标记有切口平移法、随机引物法和 PCR扩增等方法。 45讲课材料 对探针进行标记时，可复制合成一 段新的探针分子，在复制合成过程渗入 标记核苷酸，从而使整个新分子被均匀 地标记。其显著的特点是标记不局限一 个位点，而是均匀地渗入，探针的信号 强。 均匀标记 46讲课材料 切口平移法： 先由胰DNA酶I在DNA双链上随机切口，大肠杆菌DNA 聚合

20、酶I 作用以切口处开始，以另一条DNA链为模板，以4 种三磷酸脱氧核苷酸为原料，沿切口水解5端核苷酸和3端 修复加入标记核苷酸同时进行，切口平行推移，可均一标记 DNA链。 （引物延伸法） 本法与切口平移法相似，都是利用DNA聚合酶来合成与模板 互补的新的DNA链。由于DNA聚合必须从具有3-OH的末端 开始合成，因此与切口平移不同，引物延伸法需要一段与模 板序列互补的寡聚核苷酸作引物，将它与模板杂交，以提供 3-OH端。 均匀标记 47讲课材料 48讲课材料 切口平移法可对环状或线性双链DNA进行标记。一般对克 隆的DNA片段用这种方法标记的效果较好。 该方法使用时应注意： A.只能标记双链

21、DNA 使用探针时要预先变性后再使用， 而且标记时DNA片段不能太小。 B.DNA酶I使用的量要合适 太多会将DNA模板切碎，不能 进行标记反应；太少则不能有效地打开缺口，使标记物不 能进入缺口。 C.标记时间不能太短 太短时间会造成标记量不足，影响 杂交的进行。 49讲课材料 均匀标记 随机引物法 原理是使被称为随机引物的6-9个核苷酸的寡核苷酸 片段与单链DNA或变性的双链DNA随机互补结合（退火 ），以提供3-OH端，在5-3外切酶活性的DNA聚合酶 大片段作用下，在3-OH端逐个加上核苷酸直至下一个 引物。当反应液中含有标记的核苷酸时，即形成标记的 DNA探针。引物与模板的结合以一种随

22、机的方式发生， 标记均匀跨越DNA全长。 50讲课材料 51讲课材料 1、不但可用于双连DNA的标记，而 且可用于单连DNA和RNA的标记 2、操作简单 3、标记率高 随机引物标记法的特点 52讲课材料 PCR扩增 在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标记物标记 的dNTP，这样标记的dNTP就在PCR反应的同时掺入 到新合成的DNA链上。用PCR聚合酶链式反应只须极 少量的DNA模板（50100ng），即可扩增出大量高效 标记的目的片段。 若进行质粒的提取工作，需要23d完成。若直接 从菌中标记目的基因，可以缩短至23h，即可获得高 效率标记的探针。也可直接从具有目的基因载体质粒中 扩增出

23、目的基因，同时适用于不需提取质粒DNA迅速 鉴定细菌转化的转化子。 均匀标记 53讲课材料 PCR标记法 54讲课材料 末端标记 直接将探针分子的某个原子替换为放射性同位 素原子，或直接在探针分子上加上标记的原子 或复合物，这种直接标记一般是在探针分子的 末端进行，所以称之为末端标记。 经过末端标记的核酸分子除作为杂交探针外， 更多的用于RNA S1核酸酶作图以及引物延伸反 应中的标记引物。 55讲课材料 56讲课材料 实验流程 FISH样本的样本的制备制备 探针的探针的制备制备 探针标记探针标记 杂杂 交交 （染色体显带）（染色体显带） 荧光显微镜检测荧光显微镜检测 结果分析结果分析 57讲

24、课材料 染色体显带 显带染色是将染色 体经过一定程序的 处理,并用特定的染 料染色后,使染色体 在其长轴上显示出 一个个明暗交替或 深浅不同的横纹,这 样的横纹就叫做染 色体的带。 食管癌细胞系24色染色体mFISH核型分析 58讲课材料 每条染色体都含有一定数量、一定排列顺序、一 定宽窄和染色深浅或明暗不同的带,这就构成了每 条染色体的带型。显示染色体带的过程称为染色 体显带。 染色体显带为染色体的研究提供了一个十分有效 的方法。 染色体的显带技术分为两大类:一类为整条染色体 的显带技术；另一类为染色体局部的显带技术。 59讲课材料 荧光原位杂交特点 1.荧光试剂和探针经济、安全； 2.探针稳定，一次标记后可在两年内使用； 3.实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位 准确； 4.FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与 放射性探针相当； 5.多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可 同时检测多种序列； 6.既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变 化,也可