Folin-酚试剂法测定蛋白质含量

1、Folin-酚试剂法测定蛋白质含量 实验目的 掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理、操作技术 掌握制作标准曲线的要领，并通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量。提高在严格时间限 定下的实验操作能力。 二、实验原理 蛋白质分子中酪氨酸可以和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷鹄酸-磷铝酸）起 蓝色反 应，此法由fol in在1921年开创。 1951年，Lowry对此法进行了改进，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了 灵敏度。 第一步：双缩月尿反应 在碱性溶液中，双缩腺（H2N0C-NH-C0NH2能）与Cu2+作用，形成紫色或紫红色的络 合物。即在碱性溶液中，蛋白质分子中的具有双

2、缩腺结构的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生 成紫红色的蛋白质- Cu2+复合物。 第二步：Fol in-酚显色反应 Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷铝酸盐-磷鹤酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝 色反应（铝蓝和鹄蓝的混合物）。蛋白质- Cu2+复合物中所含的带酚轻基的酪氨酸或色氨酸 残基还原酚试剂中的磷铝酸和磷鹄酸，生成蓝色的化合物。 在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比 较即可求出样品中蛋白质的含量。 三、实验材料 （）样品 健康人血清（300倍稀释，正常人血清蛋白质含量：6080 g/L ） （二）试剂 牛血清白蛋白标准液（200 |1

3、 g/m I ）,碱性硫酸铜溶液，Folin-酚试剂 （三）仪器与器材 V-1100分光光度计，恒温水浴箱，移液管（2mL）,洗耳球，试管6支，试管架，加样 枪，加样枪架 四、实验步骤 （一）操作步骤 见表1-1 表1-1 fol in-酚试剂法定量蛋白质实验步骤 步骤 操作 1.反应体系 取6支试管编号，按下表加入试剂，混匀 空白管标准管样品管试剂（ml） 1 2 3 4 5 6 牛血清白蛋白标准液- 0. 2 0. 4 0. 6 0. 8 - 样口口支0. 5 蒸憎水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.5 2.双缩腺反应 向各管内分别加入碱性硫酸铜溶液2.0ml ,摇匀，室温放置

4、10min 3. fo I i n-酚反应 向各管加入fol in-酚试剂0.2ml , 2s内迅i束摇匀。40C水浴10min 后，冷却至室温 4.比色测定 用500ml波长比色，用1号管作空白对照，读取各管吸光度值，每管 重复测三次，求平均值用于绘制标准曲线。 二）注意事项 1. 操作控制：fol in-酚试剂加到碱性铜-蛋白质溶液中后，必须立即混匀，使还 原反应发生在磷铝酸-磷鹄酸被破坏之前 2. 时间控制：因反应显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。第1值 试管加入2.0ml碱性硫酸铜试剂后，开始计时，1min后，第2支试管再加入2.0ml碱 性硫酸铜，以此类推。余下试剂的

5、加入步骤和检测中，每支试管间均需严格 执行1min钟的时 间间隔操作。 五、实验结果与分析 1. 现象与图片记录 操作 现象 双缩腺反应：各管内分别加入碱性 硫 溶液呈无色透明，无明显现象 酸铜溶液2.0ml ,摇匀，室温放置 10min 后 fol in-酚反应初：各管加入 foI i n- 2 5号试管溶液变黄色，颜色逐渐加深，6号试管 酚试剂0.2ml , 2s内迅速摇匀 黄色深度介于2号和3号试管之间 将各试管40C水浴10min,冷却至 2 5号试管溶液变蓝色，颜色逐渐加深，6号试管 室温 蓝色深度介于2号与3号试管之间 2. 数据记录按照表1-1记录各管在500nm波长测得的吸光度

6、值 表1-2 500nm波长吸光度值记录 各管吸光度值Asoo测定次数 1 2 3 4 5 6 0. 127 0. 33 0.46 0. 16 1 0 0.275 6 5 3 0. 128 0. 33 0.46 0. 16 2 0 0. 275 6 6 4 3 0 0. 128 0. 276 0. 336 0.467 0. 165 各管平均值 0 0. 128 0. 275 0. 336 0.466 0. 164 3. 绘制标准曲线 以A500为纵坐标，牛血清清蛋白标准液为横坐标，根据所得数据描点连线，所绘制 曲线如下 从图中可以看出线性方程：y二0.003x,将样品溶液的吸光度（即y值）代入

7、方程, 求得样品浓度为55 u g/ml 4. 结果计算 血清蛋白浓度（|ig/ml）二样品蛋白质浓度x 2x300 55 |i g/ml x2x300 =33000 Rg/ml = 33g/L 本次实验中所测结果为33g/L ,相比较正常范围(6080 g/L ),结果明显偏低, 故认为此次实验并未成功，问题分析如下 5 问题分析 问题 解析 实验所测血清蛋白浓度 偏低 1. 洗涤试管后未等试管晾干直接进行实验，导致试管内残 留的蒸f留水稀释了样品液 2. 使用加样抢移取样品液时可能少量样品液残留于枪头 3. Folin-酚反应时因实验室拥堵，器材使用受限，导致反应时 间间隔控制不一致，样品液(在第6支试管内)反 应时间相对 偏过短 6.回顾与反思 Folin-酚试剂法的优缺点有哪些？ 优点：仪器配置要求较低，使用试剂量少，节约资源 灵敏度相比双缩腺试剂法高 缺点：操作步骤多，耗时长 Folin-酚试剂专一性较低，干扰物质多，稳定性