亚能结核分枝杆菌耐药突变检测项目开展指南

1、亚能结核分枝杆菌耐药突变（GCMTB）检测项目开展指南一 结核分枝杆菌（MTB）耐药突变基因检测实验流程示意图二实验室建设1最佳结核分枝杆菌耐药突变基因检测实验室设计平面图产物分析区PCR扩增区标本制备区试剂准备区I缓冲间 缓冲间1111 *走廊-缓冲间1If 卜工作流向1)2)3)进入各个匸作区必须遵循严格的单一方向顺序。4)进入各工作区必须严格按照要求更换各区域特定颜色的丄作服，并同时佩戴 一次性手套。岀工作区之前必须脱去区域特定匚作服及手套。5）每一个工作区都应有独立的一套仪器设备及耗材（包括微量移液器、离心机、 水浴锅、试管架、一次性手套、移液枪头、离心管及冰箱等），且不同区域的仪 器

2、设备及耗材不能混用。2实验室环境1）工作区域必须始终保持清洁整齐2）所有实验台面及地面均应保持清洁.3）所有实验废料及垃圾使用专用垃圾袋装好后，封口处理。4）每次工作前后对丄作台面进行消毒液擦洗、消毒酒精擦洗工作，并在完成工 作后开启紫外灯进行灭菌。3实验室制度及人员配备1）实验室必须有完整详细的操作规章制度并严格遵守。2）操作人员需要一定的专业技术知识和经验。3）操作人员需要有强烈的责任感，工作认真细心。4）操作人员需要严格遵守MTB耐药突变基因检测工作的标准操作规程。三实验所需试剂、设备及其功能简介整个结核分枝杆菌（MMTB）耐药突变基因检测实验山以下三个实验组成：临 床痰样的处理（DNA

3、的提取），基因扩增（PCR）和杂交分析。1实验所需试剂名称用途备注裂解液提取结核菌DNA配套试剂，室温保存结核分枝杆菌耐药突变基因扩增结核分枝杆菌DNA样本PCR试剂盒检测试剂盒I（-20dC保存）结核分枝杆菌耐药突变基因杂交检测MTB耐药的五个基杂交试剂盒检测试剂盒II因的多个突变位点（4C保存）2实验所需仪器（推荐使用）及功能简介实验所需试剂所需仪器及部分耗材功能简介MTB-DNA 提取及加样裂解液电磁炉或水浴锅水浴加热，充分快速的裂解细胞， 使细菌DNA释放。台式高速离心机 转速要求：3.000 rpm将有效成分与废液分开生物安全柜为实验操作提供一个洁净，安全 的操作环境。微量移液器0.

4、 5-10ML ,10-100PL, 100-1000AL（专用）微量加样和移液1.5mL离心管（已灭菌）及管架（专 用）已灭菌移液吸头（与移液器配套） （专用）旋涡振荡器转速：2800rpm悬浮沉淀工作服及一次性手套（专用）保护操作人员同时防1匕实验污染冰箱(-20C, 4C)存放已抽提好的DNA样本记号笔，计时器等对不同样本进行编号和计时MTB - DNA 扩 增PCR试剂 盒普通PCR仪样本DNA在短时间里呈几何级数 增长。MTB-DNA 膜 芯片杂交杂交试剂 盒杂交仪型号：FINEPCRCombi-H12参数：温度范围：约5C80C 控温精度：0.5C旋转速度：040 rpm核酸分子杂

5、交电磁炉或恒温水浴锅水浴加热，使双链DNA变性成为 单链微量加样器一套(0.5-10PL, 10-100P L, 100-1000 L)(专 用)微量加样和移液移液吸头（与加样器配套）（已灭 菌，专用）和移液枪配套使用，量取不同体 积的液体试剂。冰箱4C放置杂交试剂工作服及一次性手套保护操作人员同时防1匕实验污染记号笔及计时器等对不同样本进行编号及计时量筒（lOOmL, lOOOmL）,烧杯,移 液管，洗耳球，银子，显色盒，孵 育盒，封口袋，离心管及离心管架 （1.5mL）（专用）结核分枝杆菌耐药突变基因（GC-MTB）临床检测结果及常见问题解答1 MTB耐药检测方法有哪些？1）MTB耐药检测

6、LT前常规的方法是药敬培养法，但该法操作复杂，耗时长（需3至4周），且培养困难，容易产生假阴性，以致造成误判和延误 病人的最佳治疗时间。2）MTB基因水平的检测DNA测序法：对耐药基因的PCR产物进行直接测序，然后与标准敬感株的DNA片段比较，分析碱基突变的位置和分布。它是LI前检测基因突变最可靠的方法，但操作烦琐，费用昂贵，一般用该法作为评估其它检测方法的参考。 PCR-单链构象多态性（SSCP）分析：与DA测序技术相比，SSCP更简单 易行，但SSCP只能用于基因突变的筛选，而不能确定突变的部位和性质。因此难 以满足临床研究的需要。（3）荧光定量PCR分子灯塔法:该方法适用于点突变，检测简

7、便、快速，可 及时获得结果，但所用的多通道荧光定量PCR仪价格昂贵限制了这一方法的普及。基因芯片检测技术：结核分枝杆菌耐药基因芯片检测系统采用PCR结合 反向点杂交检测技术，可确定患者是否存在MTB耐药以及产生耐药的基因突变类 型。该方法最大的优势是高效和高通量，能快速进行大样本的检测，其耐药性结 果能给临床医生提供临床用药参考和治疗方法，尤其适用于临床检测、大规模的 筛查。2亚能MTB耐药突变基因检测有何意义？1）指导临床医生进行规范合理用药，保证治疗效果及减少耐药菌株的扩 散。2）治疗不能得到满意效果时，证实耐药性的出现，并指导进一步治疗药 物的选择。3）观察测定人群中耐药结核分枝杆菌的流

8、行状况。3亚能MTB耐药突变基因检测有何技术优点？1）高通量：一次性可以检测出结核菌对利福平、异烟腓、乙胺丁醇、链 霉素四种一线抗结核药物的耐受性。2）检测时间短：可直接运用痰样进行检测，无需培养，一天时间就可以获 得检测结果，与常规的药敬培养检测方法相比，大大缩短了检测时间。3）灵敬度：能检测到的结核分枝杆菌最小量为10copies/Ml4）准确性：鉴定已知耐药性的结核分枝杆菌，结果显示相应的发生耐药性 突变的结核分枝杆菌，准确率达95%o5）特异性：鉴定不同耐药性的结核分枝杆菌，结果显示相应的结核分枝杆 菌，特异性达98%。6）重复性：取膜条重复检测已知耐药性的结核菌样本，重复性达99%4

9、什么情况下需要进行MTB耐药基因检测？一般有结核临床症状的疑似病人，在使用利福平、异烟耕、链霉素、乙胺丁 醇等药物治疗结核病前都需要进行结核耐药检测，以指导临床用药的选择。5耐药突变检出后如何治疗？根据病人既往用药史和结核杆菌耐药基因芯片检测结果，选择敬感药物治 疗。如对所有抗结核药（除二、三种效果较差的药物外）都产生耐药性的病人， 可考虑手术治疗。对一些特殊的病人如妊娠、有肝、肾等脏器功能性或器质性病 变的病人，在治疗时，考虑到抗结核药物的疗效和毒副作用，应慎重选择治疗方 案。6目前，抗结核治疗的药物主要有哪些？利福平、异烟腓、乙胺丁醇、链霉素等是临床上最常见的一线抗结核药物。 氧氟沙星、环

10、丙沙星、阿米卡星和卷曲霉素等为可供选择的治疗耐药结核病的二 线抗结核药物的品种。7为什么会产生MTB耐药性及其耐药有何危害？MTB耐药的产生除了与结核杆菌本身容易发生变异有关之外，最主要的原 因是不规范治疗、用药不合理及中断治疗。耐药结核的出现给结核病的治疗带来 了很大困难，患者必须使用二线甚至三线药物治疗，这些药物的毒副作用大、价格 昂贵、疗程长而疗效低。此外，病人长期痰菌阳性必将增大传染机率，形成恶性 循环，导致原发耐药结核病大量增加。8耐药突变株是如何产生的？耐药性是结核杆菌的重要生物学特性，包括原发性耐药、获得性耐药和耐多 药结核（MDR-MTB）等方式。耐药突变株的产生主要有以下方式

11、：1）结核杆菌本身容易发生变异，耐药菌不断生长繁殖，最终导致菌群中以耐 药菌为主（敬感菌被药物淘汰），抗结核药物即失效。2）药物与结核杆菌接触后，有的细菌发生诱导变异，逐渐适应在含药环境 中继续生存。9常见的耐药位点突变有哪些?rpoB基因突变可引起结核杆菌对利福平耐药；katG基因、inhA基因突变可引 起MTB对异烟腓耐药；embB基因突变可导致对乙胺丁醇耐药；rpsL基因突 变可引起链霉素的耐药。10耐药突变株的致病力如何？耐利福平菌株的致病率有不同程度的降低，耐异烟腓菌株的致病力显著减弱, 耐链霉素菌株的致病力一般不降低，乙胺丁醇耐药株的致病力降低，对利福平及 异烟腓同时耐药的菌株，其

12、致病力显著降低。11各耐药突变的发生率有多少？katG、inhA基因突变分别占异烟腓临床耐药菌株的50%-70%、10-35%。 当结核杆菌rpoB基因发生一个或多个位点的突变、碱基缺失或插入时，就 会对利福平耐药，约95%的利福平耐药株都是山rpoB基因改变所致。embB基因突变占乙胺丁醇耐药株的70%左右。约70%的链霉素耐药株是山 rpsL基因突变引起。12 MTB对利福平耐药的机理如何？rpoB基因是细菌RNA聚合酶P亚基的编码基因，全长3543个碱基。利 福平通过与细菌RNA聚合酶B亚基结合，抑制转录的起始，实现杀菌效果。当 其中81个碱基的核心区域一耐利福平决定区(RRDR)发生突

13、变时，包括点突 变或短的插入、缺失突变等，利福平不能与细菌RNA聚合酶B亚基结合，因而 细菌表现为对利福平的耐受性。已证明95%以上的耐利福平菌存在rpoB基因突 变。13 MTB对异烟耕耐药的机理如何？katG基因、InhA基因分别编码过氧化氢一过氧化物酶和烯酰基载体蛋口还原 酶，正常惜况下，MMTB的KatG蛋口和InhA蛋口使异烟月井活化成异烟酸，使之具有 杀菌的能力。当katG. InhA基因发生突变时，过氧化氢一过氧化物酶、烯酰基还 原酶活性下降或丧失，阻止异烟月井变成活性形式，从而导致MMTB对异烟腓产生不 同程度的耐药。14 MTB对链霉素耐药的机理如何？MTB耐链霉素(SM)的产生是山于核糖体蛋口S12编码基因(rpsL)和(或) 16SrRNA编码基因(rrs)突变所致。细菌核糖体S12蛋白与维持读码过程中产生 一些轻微的不准确性有关，rpsL基因突变就会导致S12蛋口改变，从而严格要求 核糖体只使用与每一密码子对应的氨酰一tRNA,更准确地表达inRNA上的每一个密 码，抑制了链霉素诱导的遗传密码错读而产生耐药性。15 MTB对乙胺丁醇耐药的机理如