培养基的制备与灭菌.

1、实训六培养基的制备与灭菌一、实训目标知道培养基的用途，能根据不同微生物和不同培养目的选择培养基类型。学会常用培养基的 配制、分装、无菌操作方法。了解高压蒸汽灭菌和干热灭菌的基本原理及应用范围，学会高压蒸 汽灭菌和干热灭菌的操作步骤与方法。二、实训材料用具1. 材料与药品：马铃薯、蔗糖（葡萄糖）、琼脂、可溶性淀粉、牛肉膏、蛋白胨、1 mol/L NaOH 1 mol/L HCl、K2HPO4 KNO3 MgSO?7 H2O FeSO?7 H2O等。2仪器与用具：灭菌室、超净工作台或接种箱、恒温箱、烘箱或红外线干燥箱、紫外线灭 菌灯、电炉、铝锅、天平、烧杯、量筒、培养皿、高压灭菌锅、pH试纸（5.

2、59.0）、试管、三角瓶、铁丝试管筐、试管架、漏斗及漏斗架、玻璃棒、纱布、棉花、牛皮纸、绳、记号笔等。三、实训步骤与要求（一）配制培养基1. 配方马铃薯葡萄糖琼脂培养基马铃薯 200 g 葡萄糖20 g 琼脂 1720 g水1000 mL马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA主要用于植物病原菌物的分离和培养，有时也用于植物病 原细菌；牛肉膏蛋白胨培养基（NA主要用于细菌的分离和培养。牛肉膏蛋白胨培养基牛肉浸膏 35 g蛋白胨 510 g葡萄糖 2.5 g琼脂 1720 g水 1000 mL2. 配制流程（1）称量原料 按配方比例准确称量各种原料，马铃薯称重前需洗净去皮。（2）溶化原料 制备PDA培养基

3、的马铃薯要切成小块，加水煮沸约 0.5 h后，用纱布滤去马 铃薯残渣，在马铃薯滤液中加入琼脂，继续加热使琼脂完全溶化。注意溶化琼脂过程中要控制火 力的大小并不断搅拌，以免溢出或烧焦；待琼脂完全溶化后应补充加热过程中蒸发的水分，以保 持溶液的浓度。牛肉膏蛋白胨培养基先将琼脂加水煮至溶化后，再将其他原料溶于水中。（3） 调节pH PDA培养基略带酸性，培养菌物一般不需调节 pHo培养细菌一般需调节pH至 7.27.4，可用I mol / L NaOH或 1 mol /L HCl溶液进行调节。调节时应逐滴加入 NaOH或 HCI 溶液，防止局部过酸或过碱破坏培养基成分。（4） 过滤分装 趁热用四层纱

4、布过滤培养基，分装至三角瓶时以瓶高的 1/3较为合适，分 装至试管时培养基的高度不应超过试管高度的 1/5。一般试管做斜面培养基的约装5 mL，注意培 养基不可沾污三角瓶口和试管口。（5）加棉塞 分装完毕后，用棉塞堵住管口或瓶口。（6）包扎 加塞后，将试管约每10支1捆扎好，在棉塞部分外包一层牛皮纸，以防止灭菌 时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道线绳扎好。（7）标记 在牛皮纸上用铅笔或玻璃铅笔注明培养基名称、配制日期、组别、制作人等。（二）灭菌1. 灭菌前的准备工作玻璃器皿等在灭菌前必须经正确包裹和加塞，以保证玻璃器皿于灭菌后不被外界杂菌所污 染。平皿用纸包扎或装在金属平皿筒内；三角瓶在棉塞与瓶口

5、外再包以厚纸，用棉绳以活结扎紧， 以防灭菌后瓶口被外部杂菌所污染；吸管用纸条斜着从吸管尖端包起，逐步向上卷，头端的纸卷 捏扁并拧几下，再将包好的吸管集中灭菌。2. 高压蒸汽灭菌手提式高压蒸汽灭菌锅操作方法和注意事项如下：（1）加水 打开灭菌锅盖，取出内层灭菌桶，向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁 架相平为宜。（2）装料 放回内层灭菌桶，装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而 影响灭菌效果。（3）加盖 关闭灭菌器盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对 称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。（4） 加热、排气与升压用电炉或煤气加热，并同时打

6、开排气阀。待水沸腾后，水蒸气和空气一起从排气孔排出，当有大量蒸汽排出时，维持5 min，使锅内冷空气完全排净，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。（5）保压和降压 当锅内压力上升至所需指标时，开始计时，并维持所需压力。一般用 0.1Mpa 121.5 C，试管内培养基灭菌 20 min，三角瓶内培养基灭菌30 min。待时间达到灭菌所需 时间后停止加热，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子取出灭菌物品。如果压力未降到 0时打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内 的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污

7、染。（6） 检定保存 培养基经灭菌后，必须放入25 C30 C温箱培养48 h，经检查无杂菌生长，即可保存待用（三）倒平板和摆斜面1. 制作斜面培 养基待灭菌的试管培养基竖置温度降至 50 C左右时，将试管口端搁在厚度约1 cm左右的木条或 其他器具上，使管内培养基自然倾斜，斜面的长度以不超过试管总长的 1/2 为宜，待凝固后即成 斜面培养基。2. 制作平板培养基倒平板须待盛有培养基的三角瓶或试管温度下降到 50 C左右时进行，温度过高，皿盖上的 冷凝水太多，易形成水珠落入培养基，造成污染。温度低于 50 C,培养基易于凝固无法制作平 板。先点燃酒精灯，右手托起三角瓶瓶底，左手掌边缘松动三角瓶棉塞后用小指和无名指拔出夹 住（如果三角瓶内的培养基一次可用完，则棉塞不必夹在手指中） 。为防止瓶口沾染微生物污染 培养基，将瓶口在酒精灯上稍加灼烧。用左手拇指和食指在酒精灯火焰附近打开培养皿上盖 , 右 手迅速倾入1012 mL的培养基，盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转培养皿，使培养基均匀分布， 冷凝后即成平板。将平板培养基放室温23