医院细胞遗传室实体瘤细胞培养及染色体制备作业指导书

1、医院细胞遗传室实体瘤细胞培养及染色体制备作业指导书1 目的规范实体瘤细胞培养与染色体制备过程，为临床实体瘤 细胞染色体核型分析可靠性提供质量保证。2 测定方法C02培养/手工收获3 测定原理 患者外周血培养细胞主要说明全身染色体状况，而不能 说明肿瘤标本的染色体改变，因此通过对实体瘤细胞培养可 获得大量的肿瘤细胞，再用秋水仙素处理就可获得大量中期 分裂相的细胞，制片后可以清楚地对染色体进行观察。4 性能特征经 G 显带处理后可见 300-550 条显带。5 仪器与耗材酒精灯，烧杯，天平，离心机，恒温培养箱，冰盒，载 玻片，玻片盒，光学显微镜，灭菌注射器（ 5ml ），离心管， 无菌吸管，量筒，

2、培养瓶，试剂瓶，眼科镊，眼科剪，牙科 探针，一次性平皿等。6 试剂6.1 100ml DMEM 含 10%血清培养基6.2 RPMI-1640 含 10%血清培养基 6.3秋水仙素浓度：20卩g/ml6.4 低渗液： 0.075mol/L 的 KCl 溶液6.5 卡诺固定液6.5 0.25% EDTA-trypsin6.7 生理盐水6.8 胶原酶W 1mg / ImIDMEM7 操作步骤7.1 短期培养法7.1.1 取肿瘤组织中肿瘤细胞分布较多的部分。7.1.2 在无菌条件下，将肿瘤组织放入玻璃平皿中，用含400U/ml 双抗的生理盐水反复冲洗肿瘤组织 2-3 次以去除血 液，然后吸净生理盐水

3、。7.1.3在一次性平皿中用眼科手术剪将组织剪成 1-2mm3小 块，放入装有 25 ml 组织消化液的 50ml 一次性离心管中。7.1.4.消化：空气摇床,200rpm , 37C 20-40min。7.1.5将50ml 一次性离心管中的组织溶液装入离心管，离心，1000rpm, 10min。7.1.6 去上清，加入 20ml PBS，打匀。7.1.7 离心， 1000rpm， 10min。7.1.9 细胞计数后以 106/25 接种。7.1.1037 C 5%CO2开放培养，每天观察，一般3天可见肿瘤 细胞生长。根据生长情况每隔 3天换液一次。 一般培养 6天， 待细胞生长旺盛时，按下列

4、程序处理：1）加入秋水仙素（终浓度 0.04-0.08 曲/ml ）,约4-6小时左 右。2）将培养液倒入离心管中，加入PBS或生理盐水2-3毫升，洗净含血清培养基，加 0.25% EDTA-trypsin 约 2ml 消化 3-5min ，含血清培养基终止消化。置离心管中离心，1500rpm ， 10min。3）低渗：加入 0.075M KCl 4-6ml ，吸管吹打，37 C水浴10-30min 。4）预固定：加入约1.5ml固定剂，轻混匀37 C水浴5min ,离 心， 1500rpm， 10min。5）固定：加入固定剂 8ml左右，轻混匀，37 C水浴15min。6）室温 1500rp

5、m 离心 10min ，去上清，约留 0.5ml 。7）重复固定：同第 5 步。8）离心，1500rpm, 10min，去上清。9）视管底细胞量适当加入几滴新鲜固定剂。10）滴片：每片1-2滴。75C烤箱烤片3小时，第二天行显带处理7.2 直接制片法7.2.1 取肿瘤组织中肿瘤细胞分布较多的部分。7.2.2 在无菌条件下，将肿瘤组织放入一次性平皿，用含400U/ml 双抗的生理盐水反复冲洗肿瘤组织 2-3 次以去除血 液，然后吸净生理盐水。7.2.3 在一次性平皿中用眼科手术剪将组织剪碎，吸至装有10ml 37C温育的DMEM培养液和秋水仙素（终浓度为1 pg/ml培养液）的离心管中，置37

6、C水浴60min ,在此时内 每 6-8min 用吸管反复吹打细胞，以使细胞间相互充分解离。724 离心，1500rpm，0min，去上清，加入 0.075M KCl 4-6ml , 吸管吹打，37 C水浴10min。7.2.5 重复步骤 47.2.6 预固定：在每个离心管中加入 1.5ml 的固定液，继续37oC水浴，5 min。7.2.7 离心：1500rpm,离心10min，弃上清液。7.2.8 固定：在离心管中加入固定液 6-8ml ，立即用吸管轻 轻吹打成细胞悬液， 在室温中固定 15min 后，离心， 1500rpm， 10min ，弃上清液。7210 离心，1500rpm, 10

7、min，去上清.7.2.11 视管底细胞量适当加入几滴新鲜固定剂。7.2.12滴片：每片1-2滴，75C烤箱烤片3小时，第二天行 显带处理。7.3 针刺取材法（用于各种淋巴瘤）7.3.1 在无菌的条件下， 用 10ml 注射器穿入淋巴组织或淋巴 后抽吸。7.3.2将每1ml抽吸物注入一瓶 RPMI-1640含血清培养基中。7.3.3 细胞培养：直立于 5%CO2 37 0.5 cC培养箱内培养14-48 小时。7.3.4 秋水仙素处理：培养终止前在培养基中加入浓度为 20卩g/ml的秋水仙素 0.05-0.1ml ，使最终浓度为 0.04-0.08卩g/ml，置5%CO2,3 0.5 oC培养

8、箱中处理 2-4小时。7.3.5 低渗处理：秋水仙素处理完毕后，小心地从温箱中取 出培养瓶，用吸管吸取培养物入离心管，离心（ 1500rpm， 10min ）。然后加入温育的低渗液 8ml，用吸管轻轻吹打成细 胞悬液，置37oC水浴处理20-30min。7.3.6 预固定：在每个离心管中加入 1.5ml 的固定液，继续 37oC 水浴，5 min。7.3.8 固定：在离心管中加入固定液 6-8ml ，立即用吸管轻轻吹打成细胞悬液，在室温中固定15min后，离心，1500rpm, 10min，弃上清液。7.3.9 再固定：同第 8 步。7.3.10 视管底细胞量适当加入几滴新鲜固定剂。7.3.1

9、1滴片：每片1-2滴，75C烤箱烤片3小时，第二天行 显带处理。7.4 胸腹水恶性细胞染色体的制作7.4.1在无菌的条件下，取新鲜的胸腹水10ml，离心，lOOOrpm，10min，弃上清液。7.4.2在离心管中加入10ml37 C温育的1640完全培养液和秋水仙素（终浓度为 0.05 pg/ml培养液），置37 C水浴60-90min 。7.4.3 离心，1500rpm,10min，去上清，加入 0.075M KCl 4-6ml , 吸管吹打，37 C水浴3-5min。7.4.4 预固定：在每个离心管中加入 1.5ml 的固定液，继续 37oC水浴不5 min。7.4.5 离心1500rpm,离心10min，弃上清液。7.4.6 固定：在离心管中加入固定液 6-8ml ，立即用吸管轻 轻吹打成细胞悬液， 在室温中固定 15min 后，离心， 1500rpm，10min，弃上清液。8 注意事项取肿瘤组织时要尽可能取肿瘤细胞分布较多的部分，避 开坏死液化部分，但有些复发性、浸润性较强的肿瘤较难取 到较为纯净的