发酵工程的研究状况和进展课件

1、1 发酵工程的研究状况和进展发酵工程的研究状况和进展 陈陈 坚坚 江南大学江南大学 2 发酵工程的研究状况发酵工程的研究状况 3 生物质原料 化学品化学品 精细化学品精细化学品 大宗化学品大宗化学品 食品添加剂食品添加剂 生物塑料生物塑料 溶剂溶剂 酚类酚类 粘合剂粘合剂 脂肪酸脂肪酸 碳黑、颜料碳黑、颜料 燃料、香料、墨水燃料、香料、墨水 洗涤剂洗涤剂 生物能源生物能源 生物酒精生物酒精 生物柴油生物柴油 甲醇甲醇 氢气氢气 沼气沼气 工业生物技术主要部分工业生物技术主要部分-发酵工程发酵工程 4 发酵：生物发酵：生物 反应过程反应过程 上游上游 加工过程加工过程 加工过程加工过程 下游下游

2、 成本经济学成本经济学 原料原料 的生物的生物 具有具有 应用价值应用价值 目的产物目的产物 大规模大规模 工艺开发工艺开发 传统诱传统诱 变、分变、分 子生物子生物 学、组学、组 学学 发酵工程发酵工程 广义的概念：生物学广义的概念：生物学(微生物学、微生物学、 生物化学生物化学)和工程学和工程学(化学工程化学工程) 结合结合 t 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 1 2 3 E qs / h -1 t / h 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 10 20 30 40 50 60 1 2 3 F q p / h 0 0.2 0.4 0.6 0.8 m / h -1 1 2 3 -

3、1 D 狭义的发酵概念：微生物培养狭义的发酵概念：微生物培养 和代谢过程和代谢过程 微生物生长微生物生长 底物消耗底物消耗 产物生成产物生成 5 获得应用价值的微生物 反应器及过程放大 发酵过程优化和控制 发酵工程研究发酵工程研究 发酵产物分离提取 6 发酵工程的关键问题和工程意义发酵工程的关键问题和工程意义 微生物能够积累最大目的产物微生物能够积累最大目的产物( 产量产量)的的条件条件是什么？是什么？ 高产量高产量 便于产品分便于产品分 离提取离提取 关键问题关键问题1工程意义工程意义1 相关：微生物生理、遗传特性和营养、环境因素 7 底物最多被微生物转化为产物底物最多被微生物转化为产物 (

4、转化率转化率)的的条件条件是什么？是什么？ 粮食原料为底物粮食原料为底物 高转化率高转化率 降低原料成本降低原料成本 关键问题关键问题2 工程意义工程意义2 相关：微生物代谢途径和过程条件 发酵工程的关键问题和工程意义发酵工程的关键问题和工程意义 8 微生物最快速度发酵生产目的微生物最快速度发酵生产目的 产物的产物的条件条件是什么？是什么？ 分批操作为主分批操作为主 高生产强度高生产强度 缩短生产周期缩短生产周期 工程意义工程意义3关键问题关键问题3 相关：微生物反应动力学和系统优化 发酵工程的关键问题和工程意义发酵工程的关键问题和工程意义 9 条件 确定 过程 优化 初始 条件 过程 分析

5、过程 强化 发酵优化的研究思想：发酵是一个过程发酵优化的研究思想：发酵是一个过程 10 基于细胞表观特性进行优化基于细胞表观特性进行优化 0 4 8 12 16 t / h d (DCW) / (g/L) A 0 20 40 60 80 100 120 140 t / h r (Glucose) / (g/L) B 0 20 40 60 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80 t / h r (Pyruvate) / (g/L) C 基于细胞内部分析进行优化基于细胞内部分析进行优化 高产量高产量 高底高底 物转物转 化率化率 高生高生 产强产强 度度 优化策略优化策略 在理论

6、和技术上有突破在理论和技术上有突破, ,在工业生产中能广泛应用在工业生产中能广泛应用 显著提高发酵过程的经济性和科学性 研究方法研究方法 11 1 1 优化优化微生物生长的物理和化学环境微生物生长的物理和化学环境 保证保证微生物生长处于最适条件微生物生长处于最适条件 基本思想 奠定基础 基于基于底物运输、生化反应、产物排出底物运输、生化反应、产物排出 确定确定不同环境条件对微生物生长不同环境条件对微生物生长 和代谢产物分布的影响和代谢产物分布的影响 Prod. Distribution 发酵 优化 12 培养基组成的优化技术 发酵环境条件的优化技术 确定培养基组分的最小用量，避免底物的过量或不

7、足确定培养基组分的最小用量，避免底物的过量或不足 减少副产物的形成，使底物转化率明显提高减少副产物的形成，使底物转化率明显提高 对关键物质的浓度及其供给方式进行优化，使目标产物产对关键物质的浓度及其供给方式进行优化，使目标产物产 量明显提高量明显提高 分析不同环境条件下微生物的生理学分析不同环境条件下微生物的生理学 目的 内容 13 2基于微生物代谢特性的分阶段培养技术基于微生物代谢特性的分阶段培养技术 控制环境条件在最适合细胞生长或最适控制环境条件在最适合细胞生长或最适 合产物合成的水平合产物合成的水平。 目目 的的 分分 析析 不同不同T、pH、 RPM、DO 发酵过程的动力学参数发酵过程

8、的动力学参数(， qp， ，qs) 流变学参数的变化特性流变学参数的变化特性 分阶段控制策略分阶段控制策略 提提 出出 分阶段分阶段T、 pH、RPM、 DO 发酵 优化 14 利用利用分阶段培养技术还可以将细胞生长期和产物分阶段培养技术还可以将细胞生长期和产物 形成期人为分开形成期人为分开，从而实现优化发酵过程的目的。，从而实现优化发酵过程的目的。 T，pH, DO, RPM 15 3基于反应动力学和人工智能的优化和控制技术基于反应动力学和人工智能的优化和控制技术 建立动力学模型，求解参建立动力学模型，求解参 数并评价其适用性数并评价其适用性 对发酵进程和产量对发酵进程和产量 指标进行预测指

9、标进行预测 ModelForm Monod Constant yield u = umax s/(K m + s) Y x/s = Y0 Substrate inhibition Constant yield u = umax s/(Km + s + s2/Ki) Y x/s = Y0 Substrate inhibition Variable yield u = umax s (1 - T. s)/(K m + s + s2/Ki) Y x/s = Y0 (1 - T. s)/(1 + R. s + G. s2) Substrate and product inhibition Inhibi

10、tions Constants yields u = umax s/(Km + s + s2/Ki) u = umax o (1 - P/P m ) q p = alpha. u+ beta alpha, beta and Y p/s 以数学模型为基础的优化 优化发酵过程优化发酵过程 发酵 优化 16 以生理模型为基础的优化以生理模型为基础的优化 采用人工神经网络、专家系采用人工神经网络、专家系 统、模糊逻辑控制技术统、模糊逻辑控制技术 对发酵过程对发酵过程 进行在线状进行在线状 态预测和模态预测和模 式识别式识别 自适应最优自适应最优 化控制系统化控制系统 的开发、计的开发、计 算机模拟和算

11、机模拟和 实际应用实际应用 17 4 参参考考已知的生化反应计量关系、已知的生化反应计量关系、 代谢途径、生理、特征，代谢途径、生理、特征，构建构建、 合成不同产物的合成不同产物的代谢网络代谢网络。 利用利用代谢通量分析方法，代谢通量分析方法，计算计算得得 出胞内出胞内各条代谢途径的通量变化各条代谢途径的通量变化。 发酵 优化 18 分析分析不同发酵产品合成途径中不同发酵产品合成途径中主要代谢节点的性质主要代谢节点的性质， 结合发酵过程中胞内能量代谢情况，结合发酵过程中胞内能量代谢情况，提出提出一系列发酵一系列发酵 优化策略优化策略。 19 长期胁迫可遗传性的应长期胁迫可遗传性的应 答（遗传变

12、异）答（遗传变异） 短期胁迫不可遗传性的短期胁迫不可遗传性的 应答（生理性的应答（生理性的) Pyruvate NAD+ NADH ADP ATP ethanol Anaerobic Aerobic Mitochondrion ATP 环境压力或胁迫环境压力或胁迫 饥饿、高温、高压、机械剪切、冷冻、强酸、强碱、饥饿、高温、高压、机械剪切、冷冻、强酸、强碱、 高渗透压（高盐）、活性氧、有毒化学物质等等高渗透压（高盐）、活性氧、有毒化学物质等等 细胞结构、基因转录和蛋白表达的临时改变，酶原的细胞结构、基因转录和蛋白表达的临时改变，酶原的 激活以及代谢途径的临时调整等激活以及代谢途径的临时调整等 5

13、基于基于环境胁迫条件下微生物生理应答的过程环境胁迫条件下微生物生理应答的过程 优化技术优化技术 发酵 优化 20 研究一些重要的工业微生物的抗胁迫因子及其抗胁迫研究一些重要的工业微生物的抗胁迫因子及其抗胁迫 机制，考察环境胁迫条件下特定微生物蛋白转录和代机制，考察环境胁迫条件下特定微生物蛋白转录和代 谢途径变化，谢途径变化，采用不同环境胁迫手段或措施对微生物采用不同环境胁迫手段或措施对微生物 的生长或代谢进行调控，促进微生物生长或大量合成的生长或代谢进行调控，促进微生物生长或大量合成 目的产物。目的产物。 学术思想学术思想 21 学术思想学术思想 6基于微生物代谢的辅因子调控的过程优化技术基于

14、微生物代谢的辅因子调控的过程优化技术 Cofactors Metal ions NADH/NAD+ NADPH/NADP+ ATP/ADP/AMP CoA/Acetyl-CoA Vitamins 发酵 优化 研究辅因子形式及其浓度在物质代谢和信号传递途径中控制代谢研究辅因子形式及其浓度在物质代谢和信号传递途径中控制代谢 流方向和流量分配的作用机制、物质流和辅因子流的变化规律，流方向和流量分配的作用机制、物质流和辅因子流的变化规律， 对微生物的生长或代谢进行调控，对微生物的生长或代谢进行调控，促进微生物合成目的产物的代促进微生物合成目的产物的代 谢流的最大化和快速化。谢流的最大化和快速化。 22

15、 蛋白质组学蛋白质组学 组学组学 Discovery-driven 转录组学转录组学代谢组学代谢组学 通量组学通量组学 DNA芯片技术芯片技术 二维电泳二维电泳/质谱技术质谱技术 多维色谱多维色谱/质谱技术质谱技术 同位素同位素-核磁共振技术核磁共振技术 计算生物学计算生物学 基因组模型化技术基因组模型化技术 实验生物科学实验生物科学 Hypothesis-driven 分子遗传学分子遗传学 分子微生物学分子微生物学 蛋白质工程蛋白质工程 结构生物学结构生物学 代谢工程代谢工程 重组重组DNA 技术技术 蛋白质结晶及蛋白质结晶及 晶体衍射技术晶体衍射技术 酶的定向酶的定向 进化技术进化技术 高

16、通量高通量 筛选技术筛选技术 微生物生理学微生物生理学 反向代谢反向代谢 工程技术工程技术 细胞功能认识细胞功能认识 和优化和优化 生物学知识和技术生物学知识和技术 23 工程学方法和规律工程学方法和规律 工业生工业生 物物 过程过程 细胞群体效应细胞群体效应 生化、生理特性分析生化、生理特性分析 物质和能量传递模型物质和能量传递模型过程放大原理和策略过程放大原理和策略 发酵优化发酵优化 系统全局优化与集成系统全局优化与集成 过程优化过程优化 细胞群体效应调细胞群体效应调 控的直接放大控的直接放大 生物生物/ /化学方法化学方法 级联的系统优化级联的系统优化 多产物联产目标多产物联产目标 的全

17、局调控的全局调控 发 现发 现 和 认和 认 识识 创 新创 新 技 术技 术 和 方和 方 法法 集成集成 优化优化 细胞细胞 群体群体 单元单元 过程过程 系统系统 优化优化 反应反应/ /分离单元耦分离单元耦 合集成合集成 生物生物/ /化学级联方化学级联方 法法 多目标联产方法多目标联产方法 耦合技术耦合技术 基于生理特性的直基于生理特性的直 接放大接放大 过程集成过程集成 24 发酵工程研究举例发酵工程研究举例 25 举例举例1：丙酮酸发酵：丙酮酸发酵 Glucose Pyruvate Alanine AcetaldehydeEthanol Citrate OAA -KG AcCoA

18、 Pyruvate OAA PDH (B1, NA) PDC (B1) PT (B6) PC (Bio) B1： 硫胺素硫胺素 NA： 烟酸烟酸 Bio：生物素：生物素 B6： 吡哆醛吡哆醛 Glucose Pyruvate 如何得到丙酮酸高产量发酵？如何得到丙酮酸高产量发酵？-菌株选育和培养条件优化菌株选育和培养条件优化 X X X X 选育自身不能合成维生素的酵母选育自身不能合成维生素的酵母( (维生素缺陷型维生素缺陷型) ) 控制培养基中维生素浓度控制培养基中维生素浓度 Li Y ，Chen J ， Lun S. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001, 55

19、:680-685, 57:471-479. Li Y, Chen J, Liang D, Lun S-Y. J. Biotechnol. 2000, 81:27-34 26 t 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 1 2 3 E qs / h -1 t / h 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 10 20 30 40 50 60 1 2 3 F q p / h 0 0.2 0.4 0.6 0.8 m / h -1 1 2 3 -1 D 动力学分析 高高溶氧溶氧下，丙酮酸转下，丙酮酸转 化率较高，但生产强化率较高，但生产强 度度(葡萄糖消耗速度葡萄糖消耗速度)较较 低低 低溶氧下，葡萄

20、糖消低溶氧下，葡萄糖消 耗速度加快，然而丙耗速度加快，然而丙 酮酸产率却明显下降酮酸产率却明显下降 代谢网络分析 Pyr Et 14.7 PEP 74.6 5.5 OAA AcCoA 7.9 Pyr Et 14.7 PEP 74.6 5.5 OAA AcCoA 7.9 DO=10% Pyr Et 2.4 PEP 94.6 6.1 OAA AcCoA 8.7 Pyr Et 2.4 PEP 94.6 6.1 OAA AcCoA 8.7 DO=85% PEP到Pyr的通量增加 了20%，丙酮酸进一 步代谢的通量下降了 63.3% 高溶氧下转化率 高的原因 如何提高丙酮酸发酵的转化率和生产强度？如何提

21、高丙酮酸发酵的转化率和生产强度？-分阶段溶氧控制分阶段溶氧控制 辅因子分析 NADHATP 39.0 NADHATP 39.0 NADHATP 20.7 NADHATP 20.7 总总ATP下降下降31.4%, NADH下降下降18.6% 生产强度 (葡萄糖消耗速度) 59 低溶氧生产强度高 的原因 DO=10% DO=85% Liming Liu, *Jian Chen. Journal of Biotechnology, 2006, 126(2):173-185 Li-Ming Liu, *Jian Chen. FEMS Yeast Research, 2006, 6:11171129 2

22、7 高产量高产量(89.4 g/L) 高产率高产率(0.636 g/g) 高生产强度高生产强度(1.95 g/(L h) 确定分阶段供氧模式:发 酵0-16 h控制kLa为450 h-1， 16 h后将kLa降低至200 h- 1 碳平衡分析 前16 h较高溶氧有利于碳 流合成细胞； 采用单一高或低供氧模式，不能同时达到高转化率和高生产强度！采用单一高或低供氧模式，不能同时达到高转化率和高生产强度！ 16 h后耗氧速率恒定，碳 流转向合成丙酮酸 结果 016h 1632h 3248h after 48h kL a / h-1 450 300 200 450 300 200 450 300 20

23、0 450 300 200 Glucose1 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Cell growth2 47 30 27 17 13 16 13 13 11 3 10 11 Pyruvate 44 41 32 80 60 55 83 70 57 82 78 41 Ethanol 2 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Residual carbon 7 27 39 3 27 29 5 17 32 14 12 48 如何提高丙酮酸发酵的转化率和生产强度如何提高丙酮酸发酵的转化率和生产强度?-?-分阶段溶氧控制分阶段溶氧控制

24、分阶段溶氧控制！如何分阶段？分阶段溶氧控制！如何分阶段？ Liming Liu,*Jian Chen. Biotechnology and Bioengineering, 2007, 97(4):825-832 Liming Liu, *Jian Chen. Journal of Biotechnology, 2006, 126(2):173-185 28 PC (Bio) OAA Glucose Acetate AcCoA PDH bypass PyruvateAcetaldehydeEthanol PDC (B1) Pyruvate PDH (B1 ) AcCoA CitrateOAA -

25、KG 10 g/L 59g/L A Glucose PyruvateAcetaldehydeEthanol PDC (B1) PC (Bio) OAA Pyruvate PDH (B1 ) AcCoA CitrateOAA -KG Acetate AcCoA PDH bypass 14 g/L 53 g/L B 辅因子调控辅因子调控 打开丙酮酸脱氢酶系打开丙酮酸脱氢酶系 (PDH)途径途径 打开丙酮酸羧化酶打开丙酮酸羧化酶 (PC)途径途径 29 L Liu, Y Li, Z Shi, G Du, *J Chen. Metabolic Engineering, 2007, 9(1):21-29

26、 Glucose PyruvateAcetaldehydeEthanol PDC (B1) PC (Bio) OAA Pyruvate PDH (B1) AcCoA CitrateOAA -KG Acetate AcCoA PDH bypass 21 g/L 48g/L C Glucose PyruvateAcetaldehydeEthanol PDC (B1) PC (Bio) OAA Pyruvate PDH (B1) AcCoA CitrateOAA -KG Acetate AcCoA PDH bypass 44 g/L 22 g/L CaCO3 D 同时打开 添加Ca2+离子，PC活性

27、受Ca2+所激活 30 举例举例2 2：维生素维生素C C发酵微生物的功能优化与调控发酵微生物的功能优化与调控 我国是世界最大的维生素我国是世界最大的维生素C生产国和出口国，生产国和出口国，2008年生产年生产 85000吨，产值吨，产值40亿，占世界市场亿，占世界市场90 小菌小菌(氧化葡萄糖氧化葡萄糖 杆菌杆菌G. oxydans ) 大菌大菌(巨大芽孢杆巨大芽孢杆 菌菌B. megaterium ) 关键科学问题：维生素关键科学问题：维生素C C发酵微生物的功能关系发酵微生物的功能关系 GluVc 现况：维生素现况：维生素C两步发酵工艺两步发酵工艺 小菌单独培养生长、产酸困难小菌单独培养

28、生长、产酸困难 大菌本身不产酸，促进小菌生长和产酸大菌本身不产酸，促进小菌生长和产酸 团队承担的国家团队承担的国家863重重 点项目和国家支撑项目点项目和国家支撑项目 与南开大学功能基因组与南开大学功能基因组 学中心、国内最大学中心、国内最大Vc生生 产企业合作产企业合作 实现组学技术解决发酵实现组学技术解决发酵 工业长期问题的典型工业长期问题的典型 31 基因组测序步骤 鸟枪法测序鸟枪法测序 提取基因提取基因 组组DNA 打断基因打断基因 组组DNA 基因文基因文 库构建库构建 大规模大规模 测序测序 罗氏罗氏GSFLX高通量基因组测序高通量基因组测序 衔接子衔接子 连接连接 单链单链DNA

29、与与 磁珠结合磁珠结合 油滴中油滴中 PCR反应反应 序列拼接序列拼接 测序测序 反应反应 填补缺口填补缺口 基因组注释基因组注释 代谢途径分析代谢途径分析 小菌测序小菌测序 大菌测序大菌测序 代谢途径分析代谢途径分析 代谢途径分析代谢途径分析 从代谢从代谢 途径角途径角 度解析度解析 两菌关两菌关 系系 32 氧化葡萄糖酸杆菌中心代谢途径分析氧化葡萄糖酸杆菌中心代谢途径分析 缺失编码琥珀酸盐脱氢酶的基因，缺失编码琥珀酸盐脱氢酶的基因， 柠檬酸循环不完全柠檬酸循环不完全 无编码磷酸烯醇式丙酮酸合成酶无编码磷酸烯醇式丙酮酸合成酶 ，不能通过糖异生生产，不能通过糖异生生产C6 G.oxydans基

30、因组含编码氧化戊糖磷酸基因组含编码氧化戊糖磷酸 途径和途径和D途径的全部酶基因途径的全部酶基因 缺失编码磷酸缺失编码磷酸 果糖激酶的基果糖激酶的基 因，糖酵解途因，糖酵解途 径不完全径不完全 33 蛋白质组学蛋白质组学 小菌单独发酵时小菌单独发酵时 胞内蛋白表达胞内蛋白表达 大菌存在时小菌大菌存在时小菌 胞内蛋白表达胞内蛋白表达 功能蛋白确定功能蛋白确定 ，研究大菌影，研究大菌影 响小菌产酸的响小菌产酸的 机制机制 K. VulgarB. megaterium 34 发酵发酵 优化优化 提高糖酸转化率提高糖酸转化率 提高提高VC产量产量 提高生产强度提高生产强度 基因基因 测序测序 功能功能

31、蛋白蛋白 产物产物 解析解析 3-磷酸磷酸 甘油醛甘油醛 丙酮酸丙酮酸 葡萄糖葡萄糖 TCA循环循环 大菌特定的代谢途径大菌特定的代谢途径 L-山梨酮山梨酮2-酮基酮基-L-古龙古龙 酸酸 L-山梨糖山梨糖 2-酮基酮基-L-古龙酸生产途径古龙酸生产途径 Vc 目标目标1：确定微生物之间的功能关系，提高效能：确定微生物之间的功能关系，提高效能 目标目标2：构建：构建Vc一步发酵菌株，实现重大创新一步发酵菌株，实现重大创新 举例举例2 2：维生素维生素C C发酵微生物的功能优化与调控发酵微生物的功能优化与调控 35 棉织物化学前处理工艺棉织物化学前处理工艺 SingeingDesizing Sc

32、ouring Bleaching 退浆退浆 淀粉、淀粉、PVA 精练精练 角质、果胶角质、果胶 漂白漂白 H2O2 化学品化学品/ /高温高温化学品化学品/ /高温高温 化学品化学品/ /高温高温 四种酶发酵四种酶发酵 与应用的系与应用的系 统控制优化统控制优化 效果：效果： 提高质量提高质量 节省能源节省能源 减少排放减少排放 国内外：加国内外：加 酶处理工艺酶处理工艺 本课题：本课题： 全生物处全生物处 理工艺理工艺 效益：效益： 发酵产值发酵产值5亿亿 节能能耗节能能耗15亿亿 环境效益环境效益30亿亿 举例举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术染整关键酶制剂的发酵与应用技术 Singe

33、ingDesizing Scouring Bleaching 退浆退浆 淀粉、淀粉、PVA 精练精练 角质、果胶角质、果胶 漂白漂白 H2O2 淀粉酶淀粉酶/PVA/PVA酶酶角质酶角质酶/ /果胶酶果胶酶过氧化氢酶过氧化氢酶 棉织物生物前处理工艺棉织物生物前处理工艺 36 高产菌株选育高产菌株选育 产酶微生物筛选产酶微生物筛选 菌株鉴定和遗传改造菌株鉴定和遗传改造 分子克隆和工程菌构建分子克隆和工程菌构建 发酵过程研究发酵过程研究 酶的分离与纯化酶的分离与纯化 培养基和条件确定培养基和条件确定 发酵过程优化策略发酵过程优化策略 过程放大和工业化过程放大和工业化 分段控制分段控制 流加发酵流加

34、发酵 低成本低成本 放大技术放大技术 分离与纯化方法分离与纯化方法 酶的基本性质酶的基本性质 工业化提取技术工业化提取技术 诱导胁迫诱导胁迫 举例举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术染整关键酶制剂的发酵与应用技术 37 酶制剂应用酶制剂应用 酶应用特性和作用机理酶应用特性和作用机理 复合酶和酶组分复配复合酶和酶组分复配 过程模拟和最佳条件过程模拟和最佳条件 应用效果评价应用效果评价 应用效果比较研究应用效果比较研究 经济学评价经济学评价 环境效益分析环境效益分析 举例举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术染整关键酶制剂的发酵与应用技术 38 野生菌筛选与发酵野生菌筛选与发酵 提取高纯度天然蛋

35、白提取高纯度天然蛋白 电泳电泳 主要斑点主要斑点N端测序端测序 或肽指纹术分析或肽指纹术分析 N端序列端序列/肽段分肽段分 子量数据库查询子量数据库查询 获得基因获得基因 N端测序端测序 设计核苷酸探针杂交设计核苷酸探针杂交 获得基因获得基因 生物数据库查询生物数据库查询 同源序列同源序列 保守序列分析保守序列分析 设计引物扩增设计引物扩增 相关序列片断相关序列片断 获得基因获得基因 若出发菌基因组序列为若出发菌基因组序列为 已知已知 若出发菌基因组序列若出发菌基因组序列 未知未知 Thermobifida fusca 角质酶角质酶 角质酶高产菌的构建角质酶高产菌的构建 细菌来源角质酶编码基因

36、目前在国细菌来源角质酶编码基因目前在国 内外未有报道内外未有报道 酶制剂基因鉴定流程酶制剂基因鉴定流程 举例举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术染整关键酶制剂的发酵与应用技术 39 Purification step Total protein (mg) Total activity (U) Specific activity (U/mg) Purification fold Yield (%) Crude enzyme 234.9 1229452.34 1 100 (NH4)2SO4 fractionation 46.4 5205.2112.182.1442.34 Phenyl HP Se

37、pharose FF 4.75 1521.24320.266.1212.37 DEAE Sepharose FF 2.86 1140.91398.607.619.28 Table I Summary of purification of wild-type cutinase from T. fusca 天然嗜热子囊菌角质酶的纯化天然嗜热子囊菌角质酶的纯化 通过硫酸铵沉淀、疏水色谱、阴离子交换色谱从嗜热子囊菌发酵液中分离纯化得到电泳通过硫酸铵沉淀、疏水色谱、阴离子交换色谱从嗜热子囊菌发酵液中分离纯化得到电泳 纯天然角质酶纯天然角质酶 角质酶高产菌的构建角质酶高产菌的构建 举例举例3：染整关键酶制

38、剂的发酵与应用技术染整关键酶制剂的发酵与应用技术 40 肽指纹图谱鉴定角质酶基因肽指纹图谱鉴定角质酶基因 对电泳纯天然角质酶进行肽指纹图谱分析，通过数据库比对，得到角质酶的编码基因对电泳纯天然角质酶进行肽指纹图谱分析，通过数据库比对，得到角质酶的编码基因 (Tfu_0883) 角质酶高产菌的构建角质酶高产菌的构建 举例举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术染整关键酶制剂的发酵与应用技术 41 Tfu 0883/pET-20b(+) 4558 bp bla (A p) sequence Cutinase His tag T7 promoter C olE1 pBR322 origin f1 or

39、igin T7 terminator pelB sequence BamHI (199) NcoI (1063) Tfu_0883的克隆、表达和纯化的克隆、表达和纯化 通过基因工程手段使角质酶基因在大肠杆菌中高效表达，工程菌发酵液酶活达通过基因工程手段使角质酶基因在大肠杆菌中高效表达，工程菌发酵液酶活达180 U/mL，是野生菌产酶的，是野生菌产酶的9.4倍。倍。 C u tin h y d r o ly sis p r o d u c ts F .so la n i c u tin a se h y d r o ly sis A e r a (% ) T . fu sc a c u tin

40、a se (T fu _ 0 8 8 2 ) h y d r o ly sis A e r a (% ) T . fu sc a c u tin a se (T fu _ 0 8 8 3 ) h y d r o ly sis A e r a (% ) H e x a d e c a n o ic a c id 1 5 .9 4 2 .6 2 9 .2 7 2 .0 7 1 0 .9 6 2 .8 9 9 -H e x a d e c e n o ic a c id 0 .1 3 0 .0 2 0 .0 6 0 .0 2 0 .0 9 0 .0 3 O c ta d e c a n o ic a

41、 c id 1 4 .9 9 1 .7 1 9 .2 4 3 .0 1 8 .7 7 2 .6 9 9 -O c ta d e c e n o ic a c id 1 .7 4 0 .6 1 0 .9 8 0 .3 6 1 .1 6 0 .7 9 9 ,1 2 -O c ta d e c a d ie n o ic a c id 1 .0 8 0 .2 3 1 .3 2 0 .3 7 1 .0 6 0 .2 3 1 6 - H y d r o x y h e x a d e c a n o ic a c id 1 .6 5 0 .3 1 5 .6 6 1 .1 4 4 .7 4 0 .5 4

42、1 0 ， 1 6 - d ih y d r o x y h e x a d e c a n o ic a c id 1 0 .1 8 1 .1 2 8 .2 9 2 .3 5 9 .1 5 0 .9 7 1 8 -h y d r o x y o c ta d e c a -9 -e n o ic a c id 1 .9 0 0 .3 4 1 .0 3 0 .3 2 1 .5 2 0 .1 2 1 8 -h y d r o x y o c ta d e c a -9 ,1 2 -d ie n o ic a c id 1 .9 8 0 .9 8 9 .1 9 2 .2 5 1 0 .9 1 1

43、.0 7 9 , 1 0 , 1 8 -tr ih y d r o x y o c ta d e c a n o ic a c id 1 .9 5 0 .4 2 0 .9 9 0 .1 7 1 .7 8 0 .3 5 重组重组 Tfu0883具有角质酶活性具有角质酶活性 pET-20b(+), pelB as signal peptide, C-terminal His-tag E. coli BL21(DE3)Rossetta Ammonia sulfate precipitation, Ni-column 角质酶高产菌的构建角质酶高产菌的构建 举例举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术染整

44、关键酶制剂的发酵与应用技术 42 调控调控PGL发酵过程中底物甘油发酵过程中底物甘油 的浓度和诱导物甲醇的浓度，的浓度和诱导物甲醇的浓度， 实现实现PGL的高产量和高生产强的高产量和高生产强 度度 图2-3 甲醇和菌体浓度的比值对PGL产量、 生产强度和单位细胞生产PGL的能力的影响 PGL/100 PGL productivity PGL production per cell1000 前期研究结果举例：前期研究结果举例： 甲醇和菌体浓度比值的影响甲醇和菌体浓度比值的影响 底物流加研究目标底物流加研究目标 流加策略流加策略 甲醇流加：控制甲醇流甲醇流加：控制甲醇流 速，将速，将 甲醇和菌体浓

45、度比值维持在甲醇和菌体浓度比值维持在 0.165 g/g左右左右 甘油流加：细胞快速生长，达甘油流加：细胞快速生长，达 高密度；高密度； 重组重组P. pastoris高密度发酵生产高密度发酵生产PGL的底物流加策略和温度诱导的底物流加策略和温度诱导 举例举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术染整关键酶制剂的发酵与应用技术 43 菌体生长阶段的甘油流加策略菌体生长阶段的甘油流加策略 010 20 30 40 50 60 70 0 20 40 60 80 100 0 200 400 600 800 1000 DO (%) 时间 (h) 搅拌速率 (r/min) B 010 20 30 40 50

46、 60 70 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 20 40 60 80 100 DCW, 甘油 (g/L) 时间 (h) 流加速率 (mL/h) A 细胞干重在细胞干重在63 h 达达 到到122 g/L 细胞干重在细胞干重在33 h达达 到到140 g/L 0510 15 20 25 30 35 0 20 40 60 80 100 0 200 400 600 800 1000 DO (%) 时间 (h) 搅拌速率 (r/min) B 0510 15 20 25 30 35 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 20 40 60 80 1

47、00 120 DCW, 甘油 (g/L) 时间 (h) 流加速率 (mL/h) A 重组重组P. pastoris高密度发酵生产高密度发酵生产PGL的底物流加策略和温度诱导的底物流加策略和温度诱导 举例举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术染整关键酶制剂的发酵与应用技术 44 诱导阶段的甲醇流加策略诱导阶段的甲醇流加策略 024487296120 0 100 200 300 400 500 0 10 20 30 40 50 60 70 DCW, 甲醇 (g/L), PGL (U/mL) 时间 (h) DO (%), F (mL/h), qs (g/g DCW/h) 图2-6 甲醇流加控制下的发

48、酵过程曲线 DCW PGL Methanol Feeding rate - - - qs1000 DO 诱导前期诱导前期(08 h)以以2 ml/h的速的速 度逐步提高甲醇流加速度，使度逐步提高甲醇流加速度，使 培养液中甲醇浓度接近培养液中甲醇浓度接近20 g/L； (2) 诱导中期诱导中期(890 h)将甲醇流加将甲醇流加 速度控制在速度控制在9.7 mL/h以维持体以维持体 系中甲醇浓度为系中甲醇浓度为20 g/L； 诱导后期诱导后期(90 h以后以后)，DO上升，上升， 将流速维持在将流速维持在2 mL/h。 成功将甲醇与菌体浓度比例控制成功将甲醇与菌体浓度比例控制 0.1630.171

49、 g/g。发酵结束时。发酵结束时PGL 酶活达到酶活达到430 U/mL，生产强度达到，生产强度达到 4.34 U/mL/h。 重组重组P. pastoris高密度发酵生产高密度发酵生产PGL的底物流加策略和温度诱导的底物流加策略和温度诱导 举例举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术染整关键酶制剂的发酵与应用技术 45 举例举例4 4：透明质酸发酵过程优化与控制：透明质酸发酵过程优化与控制 透明质酸三级结构透明质酸三级结构优良理化性质：粘弹性优良理化性质：粘弹性 高保湿性高保湿性 生物相容性生物相容性 食品添加剂食品添加剂关节炎治疗关节炎治疗化妆美容化妆美容 高粘度和低溶氧传递速率是高粘度和低

50、溶氧传递速率是HA发酵过程的重要瓶颈发酵过程的重要瓶颈 乳酸对细胞生长和乳酸对细胞生长和HA合成有着较强的抑制作用合成有着较强的抑制作用 细胞生长和细胞生长和HA合成之间存在对碳源和关键辅因子的竞争合成之间存在对碳源和关键辅因子的竞争 HA发发 酵存在酵存在 问题问题 46 透明质酸发酵过程的混合与传质特性优化研究透明质酸发酵过程的混合与传质特性优化研究 问题问题()()高粘度和低溶氧传递速率是高粘度和低溶氧传递速率是HA发酵过程的重要瓶颈发酵过程的重要瓶颈 溶氧溶氧 水平水平 表观表观 黏度黏度 有效搅有效搅 拌区域拌区域 体积体积 溶氧传溶氧传 递系数递系数 0 n K 3 22 2 1.

51、36 co f DPN D D r 35 0.001 op PNNDr (%)100 c a f T V T 有效搅拌区域模型有效搅拌区域模型 05101520 0 200 400 600 Culture time (h) Agitation speed (rpm) 05101520 0 100 200 300 400 500 Culture time (h) Broth viscosity (mPas) 05101520 0 20 40 60 Culture time (h) KLa (h-1) 05101520 0 30 60 90 120120 Culture time (h) DO l

52、evel (%) (a)(b) (c)(d) 有效搅拌区域控制模型的混合与传质动力学有效搅拌区域控制模型的混合与传质动力学(Va=1） 剪切力对菌体形态影响剪切力对菌体形态影响 理想理想HAHA发酵模式：低剪切、高传质、高溶氧发酵模式：低剪切、高传质、高溶氧 47 降解透明质酸提高发酵过程的混合及传质效率降解透明质酸提高发酵过程的混合及传质效率 问题问题()()高粘度和低溶氧传递速率是高粘度和低溶氧传递速率是HA发酵过程的重要瓶颈发酵过程的重要瓶颈 酶法降解酶法降解HA提高混提高混 合与传质效率合与传质效率 氧化还原降解氧化还原降解HA 提高混合与传质效率提高混合与传质效率 FT-IR分析结果

53、分析结果 过氧化氢过氧化氢/抗坏血酸氧化还原降解抗坏血酸氧化还原降解HA 氧化还原氧化还原 降解降解HA没没 有破坏其有破坏其 基本结构基本结构 单元单元 05101520 0 5 10 15 Culture time (h) Cell concentration (g/L) 05101520 0 20 40 60 80 Culture time (h) Sucrose concentration (g/L) 05101520 0 2 4 6 8 Culture time (h) HA concentration (g/L) 05101520 0 20 40 60 Culture time (

54、h) Lactic acid concentration (g/L) (a)(b) (c)(d) HA氧化还原降解对氧化还原降解对HA发酵的影响发酵的影响 添加添加H2O2/ /抗坏血酸对流体力学影响抗坏血酸对流体力学影响 48 Transglutaminase (TGase, Protein glutamine - glutamyltransferase, EC 2.3.2.13 ) 举例举例5： Transglutaminase: Activation Mechanism and Fermentation Optimization 通过通过 N-(-谷酰胺谷酰胺) 赖氨酸键交联蛋白质赖氨酸

55、键交联蛋白质 催化蛋白质中催化蛋白质中Gln的的-羧酰胺基与伯胺间发羧酰胺基与伯胺间发 生转移反应生转移反应 蛋白质脱酰胺作用蛋白质脱酰胺作用 通过形成脂键共价连接蛋白质和脂肪酸的长通过形成脂键共价连接蛋白质和脂肪酸的长 链链-羟基羟基 目前唯一商业化并大规模生产的可在蛋白质目前唯一商业化并大规模生产的可在蛋白质 间形成共价交联的酶制剂间形成共价交联的酶制剂 49 Activation Mechanism of Transglutaminase Pre-Pro-TGase Secreted from cells folding Pro-TGase Inhibitor (TAPI) Inhibi

56、tion Protease-inhibitor complexs activation Serine Protease MetalloProtease TGasePro-region (AAs) + Dongxu Zhang, Jing Wu, Miao Wang, Guocheng Du, Jian Chen. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2008 (in press). DIO:10.1021/jf8008519 Dongxu Zhang, Miao Wang, Guocheng Du, Qingxin Zhao, Jing Wu

57、, Jian Chen. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2008, 56 (9): 34033408. TAPI: surfactant protein 举例举例5： Transglutaminase: Activation Mechanism and Fermentation Optimization 50 根据该根据该TGase活化模型：在发酵过程的产酶初期活化模型：在发酵过程的产酶初期: *添加添加10 mg/mL的的CTAB，使发酵过程酶活提高，使发酵过程酶活提高21.8 %； *添加添加1000 U/mL的胰蛋白酶，使发酵过程

58、酶活提高的胰蛋白酶，使发酵过程酶活提高31.2 %。 举例举例5： Transglutaminase: Activation Mechanism and Fermentation Optimization 51 Transglutaminase Fermentation G lucose G 6P F6P G A P G 3P P E P P yr O A A R 5P H is S er C ys Trp P he Tyr A la Val L eu A sp G ly Lys T hr M et A sn Ile A cC oA C it A K G G lu P ro A rg G ln

59、 A m ino acids for other proteins A m ino acids for T G ase H is C ys S er G ly Trp P he Tyr A la Val L eu A sp A sn M et T hr Lys Ile G ln A rg P ro G lu Determine of culture medium by Analysis of amino acid metabolism using mass balances Amino acid metabolic anylysis of Streptomyces Mobaraense Guo

60、liang Yan, Guocheng Du, Yin Li, Jian Chen, Jianjing Zhong. Process Biochemistry. 2005, 40:963-968. M. Y. Zheng, Guocheng Du, J. Chen. Enzyme and Microbial Technology，2002，31(4):477-481 . Two-stage pH and agitation speed control strategy for TGase fermentation. DO1DO2DO2DO1 pH1pH2 举例举例5： Transglutami