分析灵敏度检测工作

1、分析灵敏度检测工作 1. 1.可检测的最低分析物浓可检测的最低分析物浓 度为检测系统的分析灵敏度度为检测系统的分析灵敏度 或称检测限。或称检测限。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 毒品检验毒品检验; ;肿瘤标志物肿瘤标志物; ; 特定蛋白特定蛋白; ;核酸核酸; ;激素激素; ;某些常某些常 用项目等。需要有可检出的用项目等。需要有可检出的 最低浓度或某个量最低浓度或某个量. . 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 2 2检测限术语混乱。厂商使用各种词语，检测限术语混乱。厂商使用各种词语， 如：如： 灵敏度灵敏度 ( (Sensitivity)Sensitivity)， 分析灵

2、敏度分析灵敏度( (Analytical sensitivity)Analytical sensitivity)， 最小检测限最小检测限( (Minimum detection limit)Minimum detection limit)， 功能灵敏度功能灵敏度( (Functional sensitivity)Functional sensitivity)， 检测限度检测限度( (Limit of detection)Limit of detection)， 定量限度定量限度( (Limit of quantitation)Limit of quantitation)等。等。 分析灵敏度（检

3、测限）分析灵敏度（检测限） 以下介绍的分析灵敏度分为以下介绍的分析灵敏度分为 具定性含义的检测低限；具定性含义的检测低限； 具定量含义的生物检测限；具定量含义的生物检测限； 及功能灵敏度。及功能灵敏度。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） L 二检测低限二检测低限( (LLD,Lower Limit LLD,Lower Limit of Detection)of Detection) 每次检测，总是做一个空白样每次检测，总是做一个空白样 品。检测方法常以空白响应量校品。检测方法常以空白响应量校 准至零点，再检测各个检测样品准至零点，再检测各个检测样品 的反应响应量。的反应响应量。 分析灵

4、敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 但是，空白响应量也有波动但是，空白响应量也有波动. .若若 重复多次作空白检测重复多次作空白检测, ,，以空白，以空白 （响应量）均值和标准差表示这（响应量）均值和标准差表示这 些空白响应量的平均水平和所有些空白响应量的平均水平和所有 空白响应量对于空白均值的离散空白响应量对于空白均值的离散 程度指标。程度指标。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 在确定方法性能或绘制标准曲在确定方法性能或绘制标准曲 线时，常常以空白均值表示空白线时，常常以空白均值表示空白 响应量。实际工作时，每次只做响应量。实际工作时，每次只做 一个空白，各有一个空白，各有50%5

5、0%的可能性，这的可能性，这 个空白响应量大于或小于空白均个空白响应量大于或小于空白均 值。值。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 当空白响应量小于空白均值，当空白响应量小于空白均值， 对同一个样品检测响应量（未对同一个样品检测响应量（未 扣除空白响应量），似乎反映扣除空白响应量），似乎反映 分析物要多一点，检测方法好分析物要多一点，检测方法好 象灵敏些。象灵敏些。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 当空白响应量大于空白均当空白响应量大于空白均 值，似乎原先可以检测出来值，似乎原先可以检测出来 的分析物现在测不出了。的分析物现在测不出了。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限

6、） 因此，检测方法必须要说清楚：因此，检测方法必须要说清楚： 究竟怎样才算是可检测出来的分析究竟怎样才算是可检测出来的分析 物量？物量？ 标准曲线是从零开始的，是不是分标准曲线是从零开始的，是不是分 析物量可以从零开始析物量可以从零开始？ 这就检测低限要回答的问题。这就检测低限要回答的问题。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 统计说明，如果服从正态分布规律：统计说明，如果服从正态分布规律： 各个单次检测的空白响应量有各个单次检测的空白响应量有95%95%的的 可能性为：可能性为： 2 2S S空白 空白 X X空白 空白 +2 +2S S空白 空白 即： 即： X X空白 空白 |2S

7、|2S空白 空白 空白 X 空白 X 空白 X 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 检测响应量较空白响应量均值检测响应量较空白响应量均值 大大 ，仍然认为是空白响应，仍然认为是空白响应 量的可能性只有量的可能性只有5%5%；有；有95%95%的可的可 能性属于样品内有分析物形成的能性属于样品内有分析物形成的 检测响应量，它较空白均值差检测响应量，它较空白均值差 以上。以上。 空白 S2 空白 S2 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 响应量较空白均值相差响应量较空白均值相差 以上的，还认为是空白响应以上的，还认为是空白响应 量的可能性仅量的可能性仅0.3 %0.3 %；而有；而有

8、99.7% 99.7%的可能性是样品内有的可能性是样品内有 分析物形成的响应量。分析物形成的响应量。 空白 S3 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） B X 样品检测响应信号样品检测响应信号 95% B X 检测 低限 99.7% 样品检测响应信号样品检测响应信号 无分析物无分析物有分析物有分析物 B s 3 B B X X B s3 B B X X 有分析物有分析物 无分析物无分析物 B BB B 2 2s sX X B BB B 2s2s- -X X 所以若检测样品的反应响应量所以若检测样品的反应响应量 较空白均值大，但相差较空白均值大，但相差2 2或或 以下的，只能说这些以下的，只

9、能说这些 响应量是空白样品单次检测的响应量是空白样品单次检测的 响应量，响应量，样品内没有分析物，样品内没有分析物， 或者表示：分析物量为零或者表示：分析物量为零。 空白 S3 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 检测低限定义为样品单次检检测低限定义为样品单次检 测可以达到超过测可以达到超过2 2或或 的检测响应量对应的分析物的检测响应量对应的分析物 量。量。检测系统或方法对小于检测系统或方法对小于 或等于检测低限的分析物量或等于检测低限的分析物量 只能报告只能报告“无分析物检出无分析物检出”。 空白 S3 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 通常估计通常估计95%95%或或99.

10、7%99.7%的两种可能性：的两种可能性： 95% 95%可能性：可能性： LLD= X LLD= X空白 空白+2 +2S S空白 空白 99.7% 99.7%可能性：可能性： LLD= X LLD= X空白 空白+3 +3S S空白 空白 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 注意注意: :直接读出浓度单位的检直接读出浓度单位的检 测系统对低于零的检测将报告测系统对低于零的检测将报告 零，其分布不是正态的，因此零，其分布不是正态的，因此 计算的均值和标准差不能如实计算的均值和标准差不能如实 表达检测低限的真实情况。表达检测低限的真实情况。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 检测

11、响应须以初始值表示，如：检测响应须以初始值表示，如： 吸光度、荧光、等，此时吸光度、荧光、等，此时S S 空白空白是 是 有效的。有效的。 由初始值计算均值和由初始值计算均值和标准差，然差，然 后再转换成浓度单位。后再转换成浓度单位。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 三检测生物限（三检测生物限（BLD,Biologic BLD,Biologic Limit of Detection,Limit of Detection,） 大于检测低限的响应信号，方法还大于检测低限的响应信号，方法还 不能正确报告定量结果。因为在这不能正确报告定量结果。因为在这 样低的浓度或其他量值的范围内，样低的浓

12、度或其他量值的范围内， 单次检测样品的反应响应量重复性单次检测样品的反应响应量重复性 较差。那么在多少检测响应量时才较差。那么在多少检测响应量时才 能较好地报告定量结果呢？能较好地报告定量结果呢？ 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 检测低 限 B X +2S U X-2S 生物检测限示意图 介绍两种方式介绍两种方式: : 检测生物限度检测生物限度 和功能灵敏度。和功能灵敏度。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 对多个近于检测限浓度的样品对多个近于检测限浓度的样品 （肯定不是空白样品）作重复检（肯定不是空白样品）作重复检 测，扣除了空白响应量后的样品测，扣除了空白响应量后的样品

13、检测响应量以均值和标准差归纳。检测响应量以均值和标准差归纳。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 按正态分布规律，单次检测样品按正态分布规律，单次检测样品 具有的响应量有具有的响应量有95%95%或或99.7%99.7%的可的可 能性和检测响应量均值相差能性和检测响应量均值相差2 2或或3 3 倍的响应量标准差。较倍的响应量标准差。较均值大的大的 单次响应量肯定没问题；单次响应量肯定没问题； 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 但是较均值小的那些单次响应量，但是较均值小的那些单次响应量， 若和检测低限（空白响应量上限）若和检测低限（空白响应量上限） 交叉，说明检测方法还不能单凭一交

14、叉，说明检测方法还不能单凭一 次检测区分出这是空白还是有分析次检测区分出这是空白还是有分析 物。物。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 只有样品检测响应量的只有样品检测响应量的95%95%或或 99.7%99.7%单次检测量最低值也较单次检测量最低值也较 检测低限检测低限( (LLD)LLD)大，这样就可大，这样就可 保证样品在任何情况下，单次保证样品在任何情况下，单次 检测响应量一定不是空白的检测响应量一定不是空白的 响应量；样品的分析物浓度响应量；样品的分析物浓度 可以定量地报告出来。可以定量地报告出来。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 在多个近于检测限的样品中，符合在多

15、个近于检测限的样品中，符合 这样条件的最低分析物浓度（或其这样条件的最低分析物浓度（或其 他量值）就是检测系统方法的生物他量值）就是检测系统方法的生物 检测低限。检测低限。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 生物检测低限定义为：以检测低生物检测低限定义为：以检测低 限加限加2 2或或3 3倍检测限样品标准差的响倍检测限样品标准差的响 应量所对应的分析物量，为检测系应量所对应的分析物量，为检测系 统或方法可定量报告分析物的最低统或方法可定量报告分析物的最低 浓度或其他量值的限值。浓度或其他量值的限值。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 生物检测低限（生物检测低限（BLDBLD）的

16、具体的具体 度量方式为：度量方式为： 95%95%的可能性：的可能性： BLD = LLD +2SBLD = LLD +2S检测限样品 检测限样品 99.7%99.7%的可能性：的可能性： BLD = LLD +3SBLD = LLD +3S检测限样品 检测限样品 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 本词语较完善地表示实际样品的本词语较完善地表示实际样品的 定量检测限度。在证实厂商的定量检测限度。在证实厂商的BLDBLD 说明时，应使检测限样品的浓度说明时，应使检测限样品的浓度 和厂商的说明相同。和厂商的说明相同。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 三三. .功能灵敏度（功能灵敏

17、度（Functional Functional Sensitivity,FSSensitivity,FS）功能灵敏度定功能灵敏度定 义为：以天间重复义为：以天间重复CVCV为为20%20%时对应时对应 检测限样品具有的平均浓度，确检测限样品具有的平均浓度，确 定检测系统或方法可定量报告分定检测系统或方法可定量报告分 析物的最低浓度或其他量值的限析物的最低浓度或其他量值的限 值。值。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 为了估计为了估计FSFS，须用多个检测限浓度须用多个检测限浓度 来确定在低浓度处的精密度表现，来确定在低浓度处的精密度表现， 从中选择具有或近似从中选择具有或近似20% C

18、V20% CV的某检的某检 测限浓度，确定为方法的功能灵敏测限浓度，确定为方法的功能灵敏 度。在证实厂商的度。在证实厂商的 FSFS的说明时，的说明时， 使用的检测限样品浓度应和厂商的使用的检测限样品浓度应和厂商的 说明相同。说明相同。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 四实验须考虑的因素四实验须考虑的因素 一般制备两种不同类型的样品。一般制备两种不同类型的样品。 一个是一个是“空白空白”样品，即不含有分样品，即不含有分 析物，分析物浓度为零。析物，分析物浓度为零。 第二个是第二个是”检测限检测限”样品，即含有样品，即含有 低浓度的分析物。低浓度的分析物。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏

19、度（检测限） 在有些场合下，需要备几份在有些场合下，需要备几份”检检 测限测限”样品。空白和检测限样品样品。空白和检测限样品 由检验方法作重复检测，计算各由检验方法作重复检测，计算各 自的均值和标准差。不同的检测自的均值和标准差。不同的检测 限由空白和检测限样品数据计算限由空白和检测限样品数据计算 出来。出来。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 1.1.空白液：一份空白液用作空空白液：一份空白液用作空 白检测，其他用于制备检测限样品。白检测，其他用于制备检测限样品。 理想的空白液应具有和检验的病人理想的空白液应具有和检验的病人 样品相同的基体。样品相同的基体。 分析灵敏度（检测限）分析

20、灵敏度（检测限） 理想的空白液应具有和检验的病理想的空白液应具有和检验的病 人样品相同的基体。常使用检测人样品相同的基体。常使用检测 系统的系列校准品中的系统的系列校准品中的“零标准零标准” 作为空白。对某些项目，可使用作为空白。对某些项目，可使用 术后已无某疾病的病人样品（如：术后已无某疾病的病人样品（如： 前列腺瘤术后病人的前列腺瘤术后病人的PSAPSA血清）血清） 为空白样品。为空白样品。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 2.2.检测限样品：在证实某方法的检测限样品：在证实某方法的 灵敏度性能时，对空白液加入分灵敏度性能时，对空白液加入分 析物配制成检测样品。加入的分析物配制成

21、检测样品。加入的分 析物量应是厂商说明的检测浓度。析物量应是厂商说明的检测浓度。 在建立检测限度时，应制备几份在建立检测限度时，应制备几份 检测限样品，浓度在预期检测限检测限样品，浓度在预期检测限 度的高低一些的范围内。度的高低一些的范围内。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 重复检测数：没有具体规定，但重复检测数：没有具体规定，但 常推荐做常推荐做2020次。这对检测限度实验次。这对检测限度实验 也是合理的。也是合理的。 厂商常推荐厂商常推荐1010次，是减少开支。次，是减少开支。 实验室常采纳作实验室常采纳作1010次。次。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 3.3.实验需

22、要的时间：如果主要从实验需要的时间：如果主要从 空白液的重复性了解检测低限，空白液的重复性了解检测低限， 常常就做批内或短期实验。如果常常就做批内或短期实验。如果 主要从主要从“检测限检测限”样品的重复性样品的重复性 了解定量的检测限，推荐作较长了解定量的检测限，推荐作较长 时间的实验，代表天间测定性能。时间的实验，代表天间测定性能。 实际就做实际就做1010次检测（次检测（1010天）。天）。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 计算示例计算示例: :某酶标法的甲状腺球某酶标法的甲状腺球 蛋白试剂盒的实验结果如下：蛋白试剂盒的实验结果如下： 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 1

23、.1.使用甲状腺切除后恢复健康的使用甲状腺切除后恢复健康的 病人血清为无甲状腺球蛋白的空病人血清为无甲状腺球蛋白的空 白血清。将纯化的甲状腺球蛋白白血清。将纯化的甲状腺球蛋白 加入该血清，并用空白血清作系加入该血清，并用空白血清作系 列稀释，组成列稀释，组成0 0、0.250.25、0.500.50、 1.01.0、2.02.0、4.04.0、8.0 8.0 g/Lg/L的甲的甲 状腺球蛋白样品。状腺球蛋白样品。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 2.2.对空白血清作对空白血清作1212次批内重复测次批内重复测 定；对其它系列样品天间重复测定；对其它系列样品天间重复测 定，做了定，做了

24、1212天。天。 记录所有结果，列表如下：记录所有结果，列表如下： 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 甲球 (g/L) 吸光度 (A)CV(%) 00.087 0.128 0.09800.0137 0.250.145 0.223 0.1740.0760.025333.2 0.50.165 0.239 0.1980.1000.025025.0 A 0 AA A S 分析灵敏度实验数据(1) A 0 AA A S 甲球 (g/L) 吸光度 (A) 1.00.189 0.259 0.2210.1230.0237 2.00.249 0.320 0.2710.1780.0304 4.00.321

25、 0.423 0.3580.2600.0279 8.00.432 0.504 0.4830.3850.0315 分析灵敏度实验数据(2) CV(%) 19.3 17.2 10.7 8.2 1. 1.检测低限检测低限 空白空白“0 0”组的均值为组的均值为 0.0980.098，标准差为，标准差为0.01370.0137。这里采用。这里采用 99.7%99.7%的可能性来计算检测低限。的可能性来计算检测低限。LLD LLD = A= A0 0 + 3S + 3S0 0， 现现 A A0 0 = 0.098 = 0.098，S S0 0 = 0.0137 = 0.0137， LLD = A LLD

26、 = A0 0 + 3S + 3S0 0 = 0.098 + 3 = 0.098 + 3 0.0137 = 0.139 0.0137 = 0.139 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 实际上，若以空白吸光度均值为检测实际上，若以空白吸光度均值为检测 的起点的起点0 0，那么有，那么有99.7%99.7%的可能性，每的可能性，每 次只做一个空白时，出现最高的空白次只做一个空白时，出现最高的空白 吸光度较该空白吸光度均值高吸光度较该空白吸光度均值高0.01370.0137 的的3 3倍倍 , ,即即0.041A0.041A。这些吸光度相当于这些吸光度相当于 样品中具有的甲状腺球蛋白量即为本

27、样品中具有的甲状腺球蛋白量即为本 法的检测低限。法的检测低限。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 现在现在0.250.25g/Lg/L组减去空白后的吸光组减去空白后的吸光 度均值为度均值为0.076250.07625A A。假定这段范围内假定这段范围内 甲状腺球蛋白量和吸光度间呈线性，甲状腺球蛋白量和吸光度间呈线性， 因此因此0.0410.041A A 相于相于 0.250.250.041/0.07625=0.130.041/0.07625=0.13g/Lg/L 所以本法的检测低限为所以本法的检测低限为0.130.13g/Lg/L。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 1. 1.

28、 求生物检测限求生物检测限 由前述，空白由前述，空白 血清如以现有的吸光度均值为准，有血清如以现有的吸光度均值为准，有 99.7%99.7%的可能性出现的空白吸光度可高的可能性出现的空白吸光度可高 到到0.1390.139A A。0.25g/L0.25g/L甲状腺球蛋白组甲状腺球蛋白组 减去空白后的吸光度均值为减去空白后的吸光度均值为0.076250.07625A A， 标准差为标准差为0.02530.0253A A； 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 可推测，有可推测，有99.7%99.7%的可能性出现的可能性出现 最小的吸光度为最小的吸光度为 0.076250.07625A A3

29、30.0253A0.0253A， 即即0.00040.0004A A；而空白吸光度减去空而空白吸光度减去空 白吸光度均值可能具有的最高值为白吸光度均值可能具有的最高值为 0.04110.0411A A 。这这0.00040.0004A A在空白吸光在空白吸光 度涉及的范围内。度涉及的范围内。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 0.250.25g/Lg/L不是本法的生物检测限。不是本法的生物检测限。 0.50.5g/Lg/L的的99.7%99.7%的最低吸光度为的最低吸光度为 0.02510.0251A A（已减去空白），也在空白涉已减去空白），也在空白涉 及的范围内。及的范围内。1.0

30、1.0g/Lg/L的的99.7%99.7%的最低的最低 吸光度为吸光度为0.05180.0518A A（已减去空白），在已减去空白），在 0.04110.0411A A 之外，说明之外，说明1.01.0g/Lg/L的样品的样品 的吸光度有的吸光度有99.7%99.7%的可能性，一定大于的可能性，一定大于 空白。空白。1.01.0g/Lg/L为本法的生物检测限。为本法的生物检测限。 分析灵敏度（检测限）分析灵敏度（检测限） 甲球生物检测限计算示意图 B +3SB (0.098)(0.098) 0 0 0.04110.0411 -3-3S S0.25 0.25 0.00040.0004 0.0760.076 25. 0 A +3+3S S0.25 0