16SrDNA序列分析法鉴定乳酸菌

1、第 4 期(总第 170 期)2009 年 4 月农产品加工创新版innovational edition of farm products processingno.4apr.16s rdna 序列分析法鉴定乳酸菌张洁，徐桂花，尤丽琴（宁夏大学 农学院食品系，宁夏 银川 750012）摘要：利用 16s rdna 序列分析法，对从西藏传统发酵的酸牦牛奶中分离得到的 4 株乳酸菌，分别提取 dna，经pcr 扩增后，测定其 16s rdna 序列，并与基因库中基因序列进行同源性比较，经鉴定 1 株为瑞士乳杆菌、1 株为发 酵乳杆菌、2 株为干酪乳杆菌。结果表明，该实验方法可以实现乳酸菌种级水平

2、鉴定，与传统方法相比具有简便、快 速等优点，适合实验室及工业化生产中对乳酸菌的鉴定。关键词：乳酸菌；16s rdna；鉴定中图分类号：q939.9文献标志码：aidentification of lactic acid bacteria by 16s rdna sequencingzhang jie，xu guihua，you liqin（food department，college of angriculture，ningxia univercity，yinchuan，ningxia 750012，china） abstract：sequence analysis of 16s rdna

3、was used for the identification of 4 lactic acid bacteria strains，which were isolated from the traditional fermented kurut in tibet. dna extraction of these strains was performed，and 16s rdna sequencing afterpcr amplification were carried out. the obtained gene sequences were compared with that in g

4、enbank，by sequence homologycomparison， the 4 lactic acid bacteria strains were identified as： 1 strain was lactobacillus helveticus， 1 strain was lactobacillus fermentum， 2 strains were lactobacillus casei. the result demonstrated that lactic acid bacteria identification can be achieved at species l

5、evel by16s rdna sequencing， which possessed advantages of being simple and rapid over traditional methods，and was suitable for lactic acid bacteria identification in laboratory as well as indust- rial production.key words：lactic acid bacteria；16s rdna；identification乳酸菌不是一个分类学上的名称，而是一群能从可发酵性碳水化合物产生大量

6、乳酸的革兰阳性细菌的 通称1。最新的研究资料将乳酸菌分为 23 个主要的 属、220 多个种，如乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌 属、明串珠菌属、肠球菌属、乳球菌属、肉食杆菌属 和片球菌属等2。乳酸菌对乳品工业有很重要的经济 价值，并且可用于生产其他发酵食品和食品添加剂。 因此，对乳酸菌进行快速、可靠的分类和鉴定在微生 物学和食品科学的研究中是必需的3。国内外有很多 应用经典方法，如细菌的菌落特征、菌体形态、生理 生化特性、代谢产物等对乳酸菌进行鉴定，但传统的 表型、生物化学方法鉴定微生物耗时耗力，而且培养 条件的改变可能会导致结果发生变化，即鉴定结果很 不稳定，人们希望能找到一种快速、稳定、灵敏

7、的方法用于微生物的分类研究4。随着分子生物学技术的发展，利用分子技术对细菌进行鉴定的优势日益明 显。在这一领域，16s rdna 序列分析技术取得了骄 人的成绩，已成为鉴定细菌基因性状关系应用技术中最具权威性和准确性的检测方法之一5。本 实 验 利 用 16s rdna 序列分析法对所分 离 的4 株乳酸菌进行鉴定，确定其分类学地位，进一步说 明此实验方法的可行性及有效性。1材料与方法材料菌株来源实验所用 4 株乳酸菌分离自西藏用传统工艺酿造的酸牦牛奶中，菌 号 分 别 为 xz5302， xz41301，xz43306，xz6304。1.1.2培养基与试剂tpy 液体培养基

8、（trypticase peptone yeast broth） 6。te 缓冲液、5tbe 电泳缓冲液贮液、0.5 m edta、10%sds、3 m naac、5 m nacl、1%的琼脂糖凝胶、酚 / 氯仿 / 异戊醇、氯仿 / 异戊醇，此外还需要异丙醇 、 蛋 白 酶 k、 dntp、 10 pcr buffer、 r- taq 酶 、液氮等试剂7。收稿日期：2009- 04- 21作者简介：张 洁 （1984- ），女，内蒙古人，在读硕士，研究方向：食品安全检测及功效成分提取。e- mail：。1.1.3引物16s rdna 扩增引物采用通用

9、引物，正向引物为rdna pcr 扩增体系表 1。表 116s rdna pcr 扩增体系27f （对 应 于 escherichia coil8- 27位 碱 基） ： 5取量/l组成- agagtttgatcctggctcag- 3；反向引物为 1495r（对 应 于 escherichia coil 1495- 1515 位 碱 基）： 5- ctacggctaccttgttacga- 3 ， 由北京赛百盛基 因技术有限公司合成。pcr 扩增片段约为 1 500 bp。10pcr buffer （mg2+free）dntp mix （2.5 mmol/l）引物 27f （10 pmoll

10、-）1引物 1495r （10 pmoll-）1基因组 dna 模板 （100 ngl-）12.521120.3补充至 251.1.4仪器与设备takara rtaq 酶 （5 ul ）ddh2o- 1tgl16b 型台式高速离心机 、nd1000 型 微量紫外分光光度计、ml30l 型全自动高压蒸汽灭 菌器、hhsini 恒温水浴槽、cds8000 型 upv 凝胶 成 像 分 析 系 统 、 dhp9272 型电热恒温培养箱 、 hzsh 型 水 浴 振 荡 器 、 pl303/01 型 电 子 天 平 、 tgl16ga 型高速冷冻离心机、dg82 型干燥箱、 ptc200 型梯度基因扩

11、增仪、电泳仪等。循环参数如下：94 预变性 5 min94 变性 1 min58 退火 1 min72 延伸 2 min30 个循环后 72 末端延伸 10 min。预先制备质量分数为 1.0%的琼脂糖凝胶，扩增反应完毕后，取 2 l 的 pcr 产物与 2 l 6加载缓冲液混合，加样于琼脂糖凝胶点样孔中进行电泳，电压为 5 v/cm，电泳液为 0.5tbe。电泳后，用溴化乙 锭 （eb） 染 色 2030 min，紫外灯下观察 。如 果pcr 成功，则可见到约为 1 500 bp 的条带。1.2方法1.2.1乳酸菌基因组 dn a 提取采 用 液 氮 冻 融ctab 法提取乳酸菌基因组 dn

12、a，首先将冷冻保存的菌株分别接种于 tpy 液体 培养基中，置 37 培养 24 h，经 tpy 培养液传代培 养 23 次后，取 1.5 ml 对数生长末期的菌体培养物，4 500 r/min 离心 5 min （4 ） 收集菌体，去尽培养 液。在沉淀中加入 500 l 的 te 缓冲液，用吸管反复吹打，使之重悬。用液氮反复冻融 34 次，然后 加 入 60 l 10% sds 和 10 l 20 mg/ml 蛋 白酶 k， 混 匀 ， 于 37 水 浴 保 温 1 h。再 加 入 100 l 浓 度10 mol/l ctab 溶液及 80 l 浓度为 5 mol/l nacl 溶液，混匀，

13、65 水浴保温 20 min，得到 粗 提 取 液 。在此粗提取液中加入 750 l 酚 / 氯仿 / 异戊醇 （体积 比 为 25 24 1）， 颠 倒 混 匀 10 min， 在 转 速12 000 r/min 下离心 10 min；取上清液，并加入 750 l氯仿 / 异戊醇 （体积比 241），颠倒混匀，12 000 r/min离心 10 min，弃下层物，重复 2 次。在第 2 次所得到的上清液中，加入 500 l 冷 的 异 丙 醇 ， 轻 轻 混 合，直到 dna 沉淀下来，在转速 12 000 r/min 下离心 10 min，弃去上清液，得到 dna 沉 淀 。用 1 ml体

14、积分数 70%的乙醇洗涤 dna 沉淀 2 次，并在空气 中 自 然 干 燥 。最 后 用 3060 l 灭菌去离子水溶解 dna，并加入适量的 rnasea，于 4 温度下置过夜 后，置于 - 20 保存。1.2.416s rdn a 序列测定及分析将扩增成功的 pcr 产物用冰袋保存寄到上海桑尼生物科技有限公司测序，测得菌株 16s rdna 序列后 ， 在 ncbi 上 使 用 blast 程 序 比 对 ， 从 genbank 数 据 库 中获得有关种的公认标准序列数据，并用 phylip 软件包以 neighbor join 法绘制系统发育树。2 结果与分析2.1 乳酸菌基因组 dn

15、a 提取结果液 氮 冻 融 - ctab 法提取得到供 试 菌 株 基 因 组 dna， 用 nd1 000 型微量紫外分光 光 度 计 检 测 dna 纯度及含量。基因组 dna 检测结果见表 2。表 2基因组 dna 检测结果质量浓度ng/l菌号od 值xz5302xz41301xz43306xz6304327.8299.5879.9297.52.012.072.052.10从表 2 得 知 ， 基 因 组 dna 的 浓 度 最 低 为 297.5ng/l，最高为 879.9 ng/l。od 值均在 2.0 附近。说 明 基 因 组 dna 浓 度 和 纯度较好，能满足后续 16s rd

16、na 扩增和测序的需要。1.2.2乳酸菌基因组 dn a 纯度检测取 2 l 上述制备的乳酸菌基因组 dna 原液 用nd1 000 型微量紫外分光光度计检测乳酸菌基因组 dna 的浓度以及 od 值，再取 2 l dna 原液用质量 分数 1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。1.2.3 乳酸菌 16s rdn a pcr 扩增将上述制备的乳酸菌基因组 dna 作为 pcr 扩增 的模板，采 用 25 l 反 应 体 系 进 行 pcr 扩 增 。16s琼脂糖凝胶电泳检测基因组 dna 纯度结果用质量分数为 1.0%的琼脂糖凝胶对供试菌株的 基因组 dna 作电泳检测，溴化乙锭染色后，通过凝 胶

17、成像分析系统照相并观察。基因组 dna 琼脂糖凝2.2图 1 基因组 dna 琼脂糖凝胶电泳图图 2 16s rdna pcr 扩增的琼脂糖凝胶电泳图图 3 菌株系统发育树胶电泳图见图 1。从 图 3 得 知 ， 菌 株 xz5302 与 lactobacillushelveticus （瑞士乳杆菌） 的同源性为 99%，将其鉴定 为 瑞 士 乳 杆 菌 ； 菌 株 xz41301 与 lactobacillus fermentum （发酵乳杆菌） 的同源性为 99%，将其判 定 为 发 酵 乳 杆 菌 ； 菌 株 xz43306、 xz6304 与lactobacillus casei （干

18、酪乳杆菌） 的同源性为 100%，确定其为 lactobacillus casei （干酪乳杆菌）。从图 1 看出，在约 23 000 bp 处出现荧光条带，而 且 无 明 显拖尾及条带不均匀现象，说明基因组 dna 纯度较好，能满足后续 16s rdna 扩增和测序的需要。16s rdna 区域 pcr 扩增结果用质量分数为 1.0%的琼脂糖凝胶对供试菌株的16s rdna 的 pcr 扩增产物作电泳检测，溴化乙锭染 色后，通过凝胶成像分析系统照相 并 观 察 。 16s rdna pcr 扩增的琼脂糖凝胶电泳图见图 2。2.33讨论（1） 有 细 菌 “化 石 ”之 称 的 rdna 在

19、其 碱 基 组 成、核苷酸序列、高级结构及生物功能等方面表现出 进化上的高度保守性。这种进化与保守的二重性，使 其成为目前微生物系统分类与鉴定研究中最有用和最 常用的“分子计时钟”，在细菌的鉴定中 16s rdna基 因被认为是黄金标准 （goldstandard)。16s rdna 相对分子质量适中，其基因核苷酸序列具有高度保守性。但它的保守性又是相对的，在保守区之 间 存 在910 个变异区，不同科、属、种间都具有一定的变异，通过比较各类生物的 l6s rdna 基因序列差异，可以计算它们之间的进化距离，也可以利用恒定区序列设计 引物，将 16s rdna 片段扩增出来，利用可变区序列的

20、差异对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定1。（2） 16s rdna 序列分析法是最基础的方法之一，在其他方法不能对菌群进行准确的分析鉴定时，这种方法不失为一种有效的乳酸菌鉴定方法。choi 等人7 利用 16s rdna 测序和 dna 杂交技术研究了泡菜中 乳酸菌的菌群变化，在泡菜 5 d 的发酵过程中随机分 离了120 株乳酸菌，结果发现在发酵的前中期，柠檬 明串珠菌 （l.citreum） 是优势种，然而在后期主要为 清酒乳杆菌 （l.sake） 或弯曲乳杆菌以及短乳杆菌。一般来讲，在种分类等级上，如果 2 个分类单位 间的 16s rdna 序列同源性大于 97.5%，则认为属于 同一

21、个种9。本实验以乳酸菌 16s rdna 的一段保守 区序列设计了 1 对通用引物，对分离的 4 株乳酸菌的一段 16s rdna 序列进行扩增，并将扩增产物的核苷（下转第 69 页）从 图 2 看 出 ， 在 约 1 500 bp 处出现荧光条带， 且无明显拖尾现象，说明 pcr 扩增成功，能满足后 续 16s rdna 序列测定的需要。2.4 测序及系统发育树的构建16s rdna 基因序列分析显示，菌株 xz5302 的16s rdna 基因序列长度有 1 437 bp 核 苷 酸 ， 菌 株 xz41301 的 16s rdna 基因序列长度有 1 451 bp 核苷 酸 ， 菌 株

22、xz43306 的 16s rdna 基因序列长度有 1 470 bp 核苷酸，菌株 xz6304 的 16s rdna 基因序 列长度有 1 464 bp 核苷酸。与从 genbank 中相关乳酸 菌 菌 株 的 16s rdna 基因序列进行比较，并用 dnaman 软件包以 neighbor join 法绘制系统发育树。结果如图 3 所示。应用 j . 食品科学，2005，26 （7）：266-270.马 国 礼 . 青 稞 燕 麦 茶 p . 中 国 专 利 ，200510020340.1，2005-08-03.赵生元. 红景天青稞茶酒的试验与研究 j . 酿酒科技，2007 （4）：

23、107-108.陈海华，董海洲. 大麦芽营养原麦片的研制 j . 食品科 技，2002 （12）：41-45.吕 坤 秋 . 一种青稞保健饮料及其制备方法 p . 中 国 ，200510022316.1，2005-12-16.赵生元. 青稞营养型发酵饮料酒的试验与研究 j . 酿 酒，2007，34 （2）：68-69.费镛，陈金龙. 青稞酒渣饮料及其制造方法 p . 中国，93111858.1，1993-12-08.发展趋势，将受到广大消费者的青睐，发展前景广阔。参考文献：561卢 良 恕 . 中 国 大 麦 学1996. m . 北京：中国农业出版社， 72m j， tkachuk mac

24、 gregor aedneyw. nutrient. food agri.，8composition of the hullless barley cultivar j1994，60：451-45.93臧靖巍，阚建全，陈宗道. 青稞的成分研究及应用状况j . 中国食品添加剂，2004 （4）：43-46.吕远平，熊茉君，贾利蓉，等. 青稞特性及在食品中的104!（上接第 49 页）酸序列与 genbank 上的标准序列进行比较，4 株菌与 标准株核苷酸序列的同源性都大于 97.5%，可以准确 地确定其归属。按照传统的乳酸菌常规分类方法，鉴 定 1 株 乳酸菌至种级水平往往需要 12 个 月 时

25、 间 ， 而用 16s rdna 序列分析法，只需 1 周左右的时间就 可以将 相 当数量的乳酸菌鉴定至种 。 因 此 ，16s rdna 序列分析法在乳酸菌的分类鉴定上具有极其明显的优势。参考文献：3张列，吕加平. 新版乳制品配方 m . 北京：中国轻工业出版社，2004.刘长建，权春善，范圣第. 16s rdna 和 reca-gene 对乳 酸菌32 的鉴定 j . 大连民族学院学报，2007，36（1）：50 -52.林万明. 细菌分子遗传学分类鉴定法 m . 上海：上海科 学技术出版社，1990.杨洁彬，郭兴华. 乳酸菌生物学基础及应用 m . 北 京：中国轻工业出版社，1991.（

26、美） 萨 姆 布 鲁 克 ， d.w. 拉 塞 尔 . 分 子克隆实验指南 m . 第 3 版 . 黄 培 堂 译 . 北 京 ： 科 学 出 版 社 ， 2002. choi i k， jung s h， kim b j， et al. novel leuconostoc citreum starter culture system for the fermentation of kimchi a fermented cabbage product j . antonie van leeuwen hoek，2003，84 （4）：247-253.张刚. 乳酸细菌基础、技术和应用 m . 北京：化学 工业